馬興樂(lè)，劉海潮，李會(huì)轉(zhuǎn)

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院肝膽胰脾疝外科，河南 洛陽(yáng) 471009）

膽石癥屬于消化系統(tǒng)常見(jiàn)病，其中膽固醇結(jié)石屬于最常見(jiàn)的類(lèi)型，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的變化，膽石癥的發(fā)病率呈顯著升高趨勢(shì)[1]。膽固醇從膽汁析出并結(jié)晶是膽固醇結(jié)石的首要形成條件，其中抑制或促進(jìn)膽固醇成核過(guò)程的多種因子均具有重要的調(diào)節(jié)作用。 骨橋蛋白（osteopontin,OPN）廣泛存在于多種細(xì)胞和組織中，屬于磷酸化的糖蛋白，研究[2]提示膽汁OPN 作為重要的抑核因子，具有延長(zhǎng)膽固醇成核、結(jié)晶的作用。 瘦素是機(jī)體脂肪代謝的重要因子，膽固醇由肝細(xì)胞代謝并由膽道排出，膽汁濃縮于膽囊內(nèi)，促進(jìn)膽固醇析出、結(jié)晶和沉淀，因而80%膽固醇結(jié)石存于膽囊[3]。 但現(xiàn)階段關(guān)于膽囊結(jié)石與OPN、瘦素等因子的研究資料較少，OPN、 瘦素在膽固醇結(jié)石的形成過(guò)程中如何發(fā)揮作用尚存在爭(zhēng)議。 故而，本研究探討了膽固醇結(jié)石患者膽汁成份、 膽汁中OPN 活性及血清瘦素的變化及在膽結(jié)石形成中的作用，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月-2018年8月本院經(jīng)手術(shù)治療的膽固醇結(jié)石患者60 例（膽石癥組，n=60）、60 例因膽囊息肉實(shí)施手術(shù)治療的患者（息肉組，n=60）。 膽石癥組，年齡37～69歲，平均52.2±6.8歲；性別構(gòu)成：男21 例、女39 例；結(jié)石最大徑6.2±1.9mm；其中膽囊結(jié)石單發(fā)13 例、多發(fā)47例。 息肉組，年齡39～69歲，平均54.0±6.1歲；性別構(gòu)成：男25 例、女35 例。 兩組患者的年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：膽固醇結(jié)石患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《外科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第八版中的標(biāo)準(zhǔn)。 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡39～69歲；⑵膽囊結(jié)石和膽囊息肉患者均在我院接受腹腔鏡下膽囊切除手術(shù)；⑶手術(shù)前未使用降膽固醇相關(guān)藥物、非甾體類(lèi)抗炎藥、生長(zhǎng)抑素等藥物；⑷本研究符合《赫爾辛基宣言-人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴膽囊及膽管、肝臟部位的惡性腫瘤；⑵膽道寄生蟲(chóng)?。虎菄?yán)重的肝腎功能疾??；⑷近3 個(gè)月內(nèi)具有肝膽系統(tǒng)的炎癥病史； ⑸伴有其他系統(tǒng)的重大疾病。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者全麻建立氣腹, 進(jìn)入光纖鏡頭,在鏡頭引導(dǎo)下置入劍突下及肋緣下戳卡，無(wú)損傷鉗提起膽囊，適度降低氣腹壓力，使膽囊底貼近腹壁，鏡頭引導(dǎo)下胸穿針自腹壁刺入膽囊底，抽取膽汁5ml，荷包縫合膽囊穿刺點(diǎn)后膽囊及腹壁穿刺點(diǎn)消毒。 分裝與無(wú)菌管中，低溫離心15min，1500G/min，去除雜質(zhì)及沉淀，加入膽汁保存液（0.05%氯霉素，3mM 疊氮鈉，1mM 亮抑酶肽和5mM 依地酸鈉），深低溫保存，分批檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)方法 膽汁組分濃度檢測(cè) 膽汁標(biāo)本室溫解融后，全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)GE 公司生產(chǎn)）檢測(cè)兩組膽汁中總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）水平；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清瘦素水平，OPN 濃度檢測(cè)采用ELISA 法，相關(guān)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物研究所，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑及儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

膽汁成核時(shí)間檢測(cè) 成核時(shí)間檢測(cè)參照HOLAN 等人的方法，膽汁標(biāo)本室溫解融后，超速離心，濾過(guò)膜過(guò)濾(0.22μm)，吸取膽汁460μl 加入檢測(cè)管，然后依次加入OPN （2.5mg/ml）、 白蛋白（5mg/ml）、 氯化鈣(250μmol/L 各20μl，37℃平衡30min 后每12h 在偏光顯微鏡下觀察析出情況及時(shí)間為成核時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中所有數(shù)據(jù)的分析均采用SPSS21.0 版本，年齡、膽汁酸中TC、TBA 水平等指標(biāo)采用±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；性別比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 線(xiàn)性相關(guān)分析法；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較 經(jīng)兩組獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，膽石癥組患者的膽汁酸中TC、TC/TBA 水平顯著高于息肉組（P＜0.05），膽石癥組和息肉組患者的膽汁酸中TBA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見(jiàn)表1。

表1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較（±s）

表1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較（±s）

組別 n膽石癥組息肉組t 值P 值60 60 TC（mmol/L） TBA（mmol/L）13.28±1.66 11.43±1.20 6.996 0.000 122.8±31.9 135.2±38.0-1.936 0.055 TC/TBA 0.108±0.022 0.085±0.028 5.112 0.000

2.2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時(shí)間及血清瘦素水平比較 經(jīng)兩組獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，膽石癥組患者的血清瘦素水平顯著高于息肉組（P＜0.05）； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度、成核時(shí)間均低于息肉組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見(jiàn)表2。

表2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時(shí)間及血清瘦素水平比較（±s）

表2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時(shí)間及血清瘦素水平比較（±s）

組別 n OPN 濃度（ng/ml）OPN 蛋白成核時(shí)間（d）膽石癥組息肉組t 值P 值60 60 69.41±6.52 82.50±7.78-9.989 0.000 17.51±2.04 20.83±1.20-10.866 0.000血清瘦素（ng/ml）8.40±2.73 5.28±1.50 7.759 0.000

2.3 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度 血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 線(xiàn)性相關(guān)分析法分析，膽石癥組患者的血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；見(jiàn)表3。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

膽囊動(dòng)力學(xué)異常、膽固醇結(jié)晶水合物沉著、膽囊膽汁成核、 過(guò)飽和均是形成膽固醇結(jié)石的主要生理病理機(jī)制，其中膽固醇結(jié)晶沉淀是結(jié)石形成的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5,7]。 正常條件下，膽囊膽汁中的膽固醇主要以膽固醇磷脂泡及微膠粒的形式保持溶解狀態(tài)，但是膽汁中的膽固醇超過(guò)大泡的最大承載力，膽固醇將析出、結(jié)晶和沉淀，而膽汁酸與膽固醇、磷脂的相對(duì)濃度比決定了膽固醇的溶解度。

本研究結(jié)果顯示膽石癥組患者的膽汁酸中TC、TC/TBA 水平顯著高于息肉組，膽石癥組和息肉組患者的膽汁酸中TBA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。,提示在膽囊結(jié)石的形成過(guò)程中，膽汁中膽固醇的濃度具有決定性的作用，其主要原因是膽固醇的濃度過(guò)高或過(guò)飽和，而非膽汁酸的濃度下降，提示在膽固醇結(jié)晶析出的過(guò)程中，膽汁中膽固醇濃度過(guò)高是主要的因素。

OPN 屬于分泌型磷酸化糖蛋白，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的病理生理過(guò)程，其在膽囊、肝臟及膽汁中均存在高表達(dá)，近年來(lái)才有學(xué)者[8-10]提出OPN 可能參與了膽石癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。 本研究結(jié)果顯示膽石癥組患者的血清瘦素水平顯著高于息肉組； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度、 成核時(shí)間均低于息肉組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 該結(jié)果說(shuō)明膽石癥患者瘦素水平較高、OPN 水平較低且OPN結(jié)構(gòu)上也可能存在差異，導(dǎo)致成核時(shí)間縮短及抑制膽固醇結(jié)石形成的能力下降。 肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的腺體及結(jié)石均發(fā)現(xiàn)OPN 表達(dá)，OPN 能夠抑制膽汁膽固醇的結(jié)晶生長(zhǎng)，穩(wěn)定磷脂泡和膽固醇，進(jìn)而抑制膽固醇的析出。 瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的激素，最初發(fā)現(xiàn)預(yù)脂肪細(xì)胞，瘦素受體可廣泛表達(dá)于全身各組織，因此瘦素在全身的各個(gè)臟器組織均可發(fā)揮作用。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[11-13]發(fā)現(xiàn)狗膽囊結(jié)石的形成及膽囊囊腫均與瘦素及其受體關(guān)系密切，既往的研究認(rèn)為[14]，瘦素能夠清除脂肪中的膽固醇，加速體內(nèi)的膽固醇的排泄，因此能夠引起膽汁中的膽固醇過(guò)飽和，從而更利于膽固醇結(jié)晶的形成，但在膽汁中瘦素的表達(dá)情況尚少有研究，在本組資料中膽囊結(jié)石組膽汁中瘦素的水平增高，考慮其可能通過(guò)對(duì)膽汁中膽固醇代謝的干擾促進(jìn)膽固醇結(jié)晶的析出，而且其尚可能通過(guò)調(diào)節(jié)膽囊收縮素的作用影響膽囊的排空功能[15]，進(jìn)而存進(jìn)膽囊結(jié)石的形成。

進(jìn)一步對(duì)膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度 血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)膽石癥組患者的血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈顯著正相關(guān)關(guān)系； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 該結(jié)果提示膽固醇結(jié)石患者膽汁中OPN 蛋白的濃度及活性減低、 血清瘦素水平升高, 可能與膽汁成份失調(diào)、 膽結(jié)石形成有關(guān)[16.17]。

綜上所述，膽固醇結(jié)石患者膽汁中OPN 蛋白的濃度及活性減低、血清瘦素水平升高，并且與膽汁中TC 及TC/TBA 的比值具有相關(guān)性，而在兩組患者的膽汁中TBA 的水平并未表現(xiàn)出明顯的差異。 研究結(jié)果提示在膽囊結(jié)石形成的過(guò)程中，膽汁中的膽固醇濃度過(guò)高引起的過(guò)飽和現(xiàn)象是主要的因素之一，而OPN 的濃度過(guò)低，能夠影響膽汁泡的穩(wěn)定性，導(dǎo)致晶體的析出，此外瘦素能夠通過(guò)對(duì)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)以及對(duì)膽囊收素的調(diào)節(jié)等途徑參與膽囊結(jié)石的形成過(guò)程。 提示在膽囊結(jié)石手術(shù)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)膽汁中上述成分的檢測(cè)，能夠?yàn)槟懩医Y(jié)石形形成提供進(jìn)一步的基礎(chǔ)理論，也能夠?yàn)樾g(shù)后的藥物干預(yù)提供參考依據(jù)。