韓體微，袁鳳玲，王艷鵬，曾 彬

（1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 承德 067000；2.河北省唐山市婦幼保健院生殖遺傳科，河北 唐山 063000）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是女性不孕癥的主要原因，其特征為性激素失衡（高雄激素血癥），常伴高胰島素血癥、胰島素抵抗（IR）等代謝疾?。?］。60%～70%的PCOS 患者會(huì)出現(xiàn)葡萄糖代謝異常［2］。二甲雙胍為治療2 型糖尿病常用降糖藥，可恢復(fù)PCOS 患者的排卵，降低循環(huán)雄激素水平及流產(chǎn)和妊娠糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)［3］。同時(shí)，激素療法可能引起卵巢過(guò)度活化，但緩解代謝改變的效果欠佳［4］。六味地黃丸中的地黃苦苷元具有雌激素樣活性，能與雌激素受體ERα 和GPR30 結(jié)合，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸而抑制促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）的分泌［5］。研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）／ 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路參與了葡萄糖代謝異常的調(diào)控［6］。同時(shí)，ERK 缺陷型模型小鼠顆粒細(xì)胞（次級(jí)卵泡）的增殖減少，成熟卵泡量的減少，閉鎖卵泡的增加，均會(huì)導(dǎo)致生育力下降［7］。本研究中探討了地黃苦苷元對(duì)PCOS 模型大鼠卵巢功能的改善作用及其機(jī)制，為地黃苦苷元治療PCOS 提供了理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：ASP300S 型組織脫水機(jī)、EG1150 型包埋機(jī)、RM2255 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；CX43 型顯微鏡（日本Olympus 公司）；TCX1 -FMQ9013 型放射免疫分析儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；ELITE 200 型電泳儀、E -Blotter 型濕轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Wealtec 公司）；Gls 型數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；CFX96Touch 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)BD 公司）。

試藥：地黃苦苷元（河南中醫(yī)藥大學(xué)，批號(hào)為135447-39-1，含量為95%）；二甲雙胍（中國(guó)深圳中聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)72106064）；來(lái)曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)22009132）；羧甲基纖維素（廣州逸明化工有限公司，批號(hào)為177317-30-5）；蘇木素染色液（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)為C0107）；大鼠空腹胰島素（FINS）、睪酮（T）、LH、FSH 放射免疫檢測(cè)試劑盒（中國(guó)原子能同位素研究所，批號(hào)分別為07451228，0670R95，0452R72，0592R90）；RIPA 裂解液（生工生物工程＜上海＞有限公司，批號(hào)為P0028）；PI3K、蛋白激酶B（PKB，又稱AKT）、ERK、β-actin 和山羊抗鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)分別為A1937，A1427，A0356，A2140，A0281）；Trizol 試劑盒（美國(guó)Qiagen 公司，批號(hào)為DD421）；mRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)分別為RR047A，TK08045）；

動(dòng)物：6 月齡雌性SD 大鼠50 只，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量（200±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2020-0013，動(dòng)物合格證編號(hào)2020051786。在溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光照12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 分組及建模

將50 只大鼠分為對(duì)照組（A 組）、模型組（B 組）、二甲雙胍組（C 組），以及地黃苦苷元低、高劑量組（D1組、D2組），各10 只。A 組大鼠用1%羧甲基纖維素灌胃（10 mg／kg），其余各組大鼠用等量0.1 mg／mL來(lái)曲唑灌胃，每日1 次，連續(xù)21 d，以復(fù)制PCOS 大鼠模型。灌胃第7 天開始，每天取大鼠陰道分泌物，堿性美藍(lán)染液染色，若陰道脫落細(xì)胞連續(xù)10 d 呈角化狀態(tài)，且檢測(cè)胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）＞2.8，證明模型復(fù)制成功。建模成功后，C 組灌胃二甲雙胍（270 mg／kg）［8］，D1組、D2組大鼠灌胃地黃苦苷元50mg／kg 或，200mg／kg［9］，A 組和B 組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，均每日1 次，連續(xù)21 d。

1.3 觀察指標(biāo)

卵巢組織病理形態(tài)學(xué)：末次給藥后，麻醉大鼠，分離卵巢組織。卵巢組織經(jīng)脫水、包埋、切片（3 μm），蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封固，在顯微鏡觀察大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)變化。

血液學(xué)指標(biāo)：本次給藥禁食12 h 后麻醉大鼠，心臟采血。測(cè)定FINS 及空腹血糖（FBG）水平，計(jì)算HOMAIR（HOMA-IR ＝FBG×FINS／22.5）；采用放射免疫法測(cè)定T，LH，F(xiàn)SH 水平。

mRNA 水平：取卵巢組織，Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后擴(kuò)增，反應(yīng)體系體積20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃預(yù)變性5 s；60 ℃擴(kuò)增44 s，40 個(gè)循環(huán)；61 ℃采集熒光。以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算PI3K，AKT，ERK mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

蛋白水平：取卵巢組織，研碎后加入RIPA 裂解液，冰浴2 h，12 000 g 離心10 min，取上清液，進(jìn)行電泳（30 μg／孔），將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，清洗3 次，將膜與PI3K（1 ∶300）、AKT（1 ∶400）、ERK（1 ∶400）、β-actin（1 ∶1 000）抗體4 ℃孵育過(guò)夜，回收一抗，清洗3 次將膜與山羊抗鼠IgG（1∶5000）在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像并分析，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織病理形態(tài)學(xué)

A 組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)正常，可見各期卵泡、成熟卵母細(xì)胞、黃體，細(xì)胞層呈粗大顆粒狀，排列緊密；B 組大鼠多數(shù)卵泡嚴(yán)重閉鎖，閉鎖卵泡直徑增大，顆粒細(xì)胞層被擠壓，排列稀疏，甚至消失。C 組、D1組、D2組，閉鎖卵泡的數(shù)量明顯減少，次級(jí)卵泡黃體數(shù)量增加，顆粒細(xì)胞層增厚且聚集緊密。詳見圖1。

圖1 大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)（HE，×40）Fig.1 Histopathology of rat′s ovary（HE，×40）

2.2 血漿FBG，F(xiàn)INS，HOMA-IR 水平

與A 組比較，B 組大鼠血漿FBG，F(xiàn)INS，HOMA-IR水平均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠上述指標(biāo)水平均明顯降低（P ＜0.05），且D2組降幅低于D1組。詳見表1。

表1 各組大鼠血漿中FBG，F(xiàn)INS，HOMA-IR水平比較（X±s，n＝10）Tab.1 Comparison of plasma FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR levels of rats in each group（± s，n ＝10）

表1 各組大鼠血漿中FBG，F(xiàn)INS，HOMA-IR水平比較（X±s，n＝10）Tab.1 Comparison of plasma FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR levels of rats in each group（± s，n ＝10）

注：與A 組比較，a P ＜0.05；與B 組比較，b P ＜0.05。下表同。Note：Compared with those in group A，a P ＜ 0.05；compared with those in group B，b P ＜0.05，as well as the following tables.

2.3 血清T，LH，F(xiàn)SH 水平

與A 組比較，B 組大鼠血清T、LH 和FSH 水平均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠上述指標(biāo)水平均明顯降低（P ＜0.05），且D2組降幅低于D1組。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中T，LH，F(xiàn)SH 水平比較（± s，n ＝10）Tab.2 Comparison of serum T，LH and FSH levels of rats in each group（± s，n ＝10）

表2 各組大鼠血清中T，LH，F(xiàn)SH 水平比較（± s，n ＝10）Tab.2 Comparison of serum T，LH and FSH levels of rats in each group（± s，n ＝10）

2.4 卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平

與A 組比較，B 組大鼠卵巢中PI3K 和AKT mRNA表達(dá)水平明顯降低，ERK mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠卵巢中PI3K 和AKT mRNA 表達(dá)水平明顯升高，ERK mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P ＜0.05），且D2組變化幅度大于D1組。詳見表3 和圖2。

表3 各組大鼠卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平比較（± s，n ＝10）Tab.3 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

表3 各組大鼠卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平比較（± s，n ＝10）Tab.3 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

圖2 各組大鼠卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平Fig.2 The expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group

2.5 卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組大鼠卵巢組織中PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平均明顯降低，ERK 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組大鼠卵巢中PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，ERK 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P ＜0.05），且D2組變化幅度大于D1組。詳見表4。

表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 蛋白表達(dá)水平比較（± s，n ＝10）Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK protein in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K，AKT，ERK 蛋白表達(dá)水平比較（± s，n ＝10）Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK protein in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

3 討論

PCOS 主要表現(xiàn)為激素（T 和LH）水平紊亂，IR 增強(qiáng)［10］。既往也有胰島素增敏劑（如二甲雙胍或羅格列酮）可減輕PCOS-IR 發(fā)生的報(bào)道［11］。但PCOS 患者多患有高胰島素血癥、IR 和其他代謝性病理癥狀，并非全部適合使用二甲雙胍治療［12］。

六味地黃丸可通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，降低雄激素水平并誘導(dǎo)排卵［13］。同時(shí)，IR 和葡萄糖代謝異常在PCOS 患者中很常見，地黃對(duì)IR 的作用可能還歸因于B 細(xì)胞功能的改善，這直接與胰島素分泌有關(guān)［14］。因此，作為地黃主要活性成分的地黃苦苷元可能對(duì)PCOS 具有一定治療作用。本研究結(jié)果顯示，地黃苦苷元可降低PCOS 模型大鼠血清中T，LH，F(xiàn)SH，HOMA-IR水平，同時(shí)減少閉合卵泡的數(shù)量，增加黃體數(shù)量，增厚顆粒細(xì)胞層，其治療PCOS 的效果堪比二甲雙胍，臨床應(yīng)用前景廣闊。

作為調(diào)節(jié)代謝的重要途徑，PI3K／ERK 通路也是將PCOS 與IR 連接的關(guān)鍵途徑［15］。PI3K／ERK 通路是胰島素作用的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，而PI3K／ERK 通路的改變與糖尿病、肥胖癥和其他代謝性疾病中的IR 密切相關(guān)［16］。作為跨膜胰島素受體蛋白，胰島素受體底物-1（IRS-1）具有雙向調(diào)節(jié)位點(diǎn)（絲氨酸和蘇氨酸殘基），絲氨酸的過(guò)度磷酸化對(duì)隨后的PI3K／ERK 通路產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用［17］。AKT 作為PI3K／ERK 通路的下游靶蛋白，是調(diào)節(jié)能量代謝的重要因子，在促進(jìn)糖異生中起著至關(guān)重要的作用。PI3K 激活可導(dǎo)致AKT 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，從而增強(qiáng)AKT 的轉(zhuǎn)錄活性［18］。研究顯示，PCOS-IR患者子宮內(nèi)膜的IRS-1 水平顯著升高［19］。IRS-1（S307）的磷酸化升高導(dǎo)致PI3K／ERK 通路功能障礙，隨后調(diào)節(jié)了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4 的轉(zhuǎn)運(yùn)，破壞了葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這是PCOS-IR 模型大鼠HOMA-IR 指數(shù)升高的原因［20］。在PCOS-IR 模型大鼠中，顆粒細(xì)胞中卵巢顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)基因CYP19A1 的表達(dá)降低與血清T，LH，F(xiàn)SH 的廣泛上調(diào)和雌激素的下調(diào)有關(guān)。雌二醇和FSH 水平的降低一定程度下調(diào)了AKT，進(jìn)一步促進(jìn)了PCOS-IR 模型大鼠的多囊發(fā)育［21］?？紤]到PI3K／ERK通路在PCOS 與IR 連接中的重要性，可望通過(guò)阻斷治療藥物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)緩解PCOS-IR。PI3K／ERK 通路相關(guān)基因的缺失可能導(dǎo)致卵巢早衰甚至不孕。AKT 在卵巢發(fā)育中起關(guān)鍵作用，密切參與FSH 誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞分化，影響卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和卵泡發(fā)育［22］。在AKT 缺陷小鼠中，繼發(fā)性顆粒細(xì)胞增殖和成熟卵泡減少，閉鎖卵泡增加，延長(zhǎng)了小鼠的發(fā)情周期，最終導(dǎo)致其不孕［23］。本研究結(jié)果顯示，地黃苦苷元能升高PI3K 和AKT 蛋白及mRNA 的表達(dá)水平，同時(shí)降低ERK 蛋白及mRNA 的表達(dá)水平。

綜上所述，地黃苦苷元可減輕PCOS 模型大鼠的胰島素抵抗，恢復(fù)卵巢形態(tài)，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K／ERK 通路有關(guān)。