樊明鶴， 林廣民， 黃瑞杰

（漯河市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 漯河 462000）

缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）是一類由供血功能障礙所致的腦組織壞死或功能喪失的腦血管疾病，患者因缺血、缺氧而出現(xiàn)不同程度的腦功能損傷，進(jìn)而對(duì)認(rèn)知功能、神經(jīng)功能等造成負(fù)面影響[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，ICVD占腦血管疾病的65%～85%，且發(fā)生率呈不斷上升趨勢(shì)[2-3]。動(dòng)脈粥樣硬化是ICVD發(fā)生的主要原因，而炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的2個(gè)主要機(jī)制[4]。血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是血紅素降解過程中的限速酶，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[5-6]。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是病原體相關(guān)分子模式識(shí)別受體，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的形成中起重要作用[7]。目前，關(guān)于HO-1及TLR4在評(píng)估ICVD患者預(yù)后中的報(bào)道較少見。因此，本研究擬通過探討TLR4 mRNA和HO-1水平在ICVD預(yù)后中的作用，為ICVD的治療及預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年2月—2019年12月漯河市中心醫(yī)院收治的324例ICVD患者（ICVD組），其中男190例、女134例，年齡（51.5±4.1）歲。選取同期漯河市中心醫(yī)院健康體檢者324名作為正常對(duì)照組，其中男195名，女129名，年齡（51.1±4.8）歲。2個(gè)組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)漯河市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

ICVD組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合全國第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的ICVD相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）首次發(fā)病且發(fā)病至入院時(shí)間≤24 h；（3）年齡≥18歲。

正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1個(gè)月內(nèi)體檢結(jié)果顯示無腦血管病；（2）年齡≥18歲。

ICVD組及正常對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤；（2）并發(fā)心臟疾病并可能會(huì)導(dǎo)致腦栓塞；（3）并發(fā)嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙；（4）近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生感染性疾病或感染癥狀；（5）近3個(gè)月內(nèi)服用過抗菌藥物、激素、免疫抑制劑等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的藥物；（6）合并其他嚴(yán)重疾病。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及檢測(cè) 采集ICVD患者入院當(dāng)天、正常對(duì)照者體檢當(dāng)天靜脈血6 mL，分為2管。1管1 007×g離心5 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HO-1水平，試劑盒購自南京博研生物科技有限公司[靈敏度為＜5 pg/mL、檢測(cè)范圍為156～10 000 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜9%，批間CV＜11%，標(biāo)準(zhǔn)曲線r=0.990]，檢測(cè)儀器為TECAN多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）。另1管用于檢測(cè)外周血TLR4 mRNA。采用RNA提取試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）提取外周全血RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR046A，日本Takara公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR RT-PCR試劑盒（貨號(hào)BSB22，杭州博日科技有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法測(cè)定TLR4和β-actin基因的相對(duì)表達(dá)量。每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。引物由北京鼎國生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.2 頭顱多普勒超聲 對(duì)ICVD患者進(jìn)行頭顱多普勒超聲檢查，并根據(jù)超聲結(jié)果進(jìn)行分組。輕度狹窄組最大流速100～139 cm/s，聲頻、血流信號(hào)無明顯改變；中度狹窄組最大流速140～179 cm/s，血流信號(hào)表現(xiàn)為典型束腰狀，夾雜低頻雜音；重度狹窄組最大流速≥180 cm/s，聲頻信號(hào)呈波峰圓潤，血流信號(hào)發(fā)生色彩翻轉(zhuǎn)。

1.3.3 美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分[9]采用NIHSS評(píng)分評(píng)估ICVD患者的神經(jīng)功能缺損程度，并分組。輕度損傷組NIHSS評(píng)分≤4分，中度損傷組NIHSS評(píng)分為4～20分，重度損傷組NIHSS評(píng)分＞20分。

1.3.4 隨訪 對(duì)ICVD患者隨訪6個(gè)月，依據(jù)改良Rankin量表（modified Rankin scale，MRS）[10]的得分情況及并發(fā)癥（認(rèn)知功能障礙、癲癇發(fā)作、肺部感染等）發(fā)生情況進(jìn)行分組。預(yù)后較好組MRS評(píng)分為0～2分，未出現(xiàn)并發(fā)癥；預(yù)后不良組MRS＞2分或出現(xiàn)并發(fā)癥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估HO-1及TLR4 mRNA與NIHSS評(píng)分的相關(guān)性，采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估HO-1及TLR4 mRNA與顱動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICVD組與正常對(duì)照組一般資料比較

ICVD組與正常對(duì)照組之間吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、心臟疾病史、高脂血癥比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

表2 ICVD組與正常對(duì)照組一般資料比較 例

2.2 ICVD組與正常對(duì)照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組（P=0.000）。見表3。

表3 ICVD組與正常對(duì)照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

表3 ICVD組與正常對(duì)照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

注：空白表示無此項(xiàng)。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA ICVD組 324 4.18±2.52 1.21±0.57正常對(duì)照組 324 2.10±1.11 0.31±0.10 t值 10.369 27.994 P值 0.000 0.000

2.3 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

輕度狹窄組、中度狹窄組及重度狹窄組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

表4 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

注：與輕度狹窄組比較，*P＜0.05；與中度狹窄組比較，#P＜0.05；空白表示無此項(xiàng)。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA輕度狹窄組 93 3.06±1.80 0.87±0.41中度狹窄組 152 4.11±2.32* 1.11±0.50*重度狹窄組 79 5.89±2.19*# 1.36±0.44*#F值 56.836 22.012 P值 0.000 0.000

2.4 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

輕度損傷組、中度損傷組及重度損傷組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

表5 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

注：與輕度損傷組比較，*P＜0.05；與中度損傷組比較，#P＜0.05；空白表示無此項(xiàng)。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA輕度損傷組 88 3.02±1.90 0.80±0.39中度損傷組 153 4.48±2.30* 1.18±0.58*重度損傷組 83 5.88±2.32*# 1.56±0.30*#F值 31.098 39.024 P值 0.000 0.000

2.5 ICVD組HO-1及TLR4 mRNA與狹窄程度、NIHSS評(píng)分的相關(guān)性

ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量與顱動(dòng)脈狹窄程度、NIHSS評(píng)分均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表6。

表6 ICVD組HO-1及TLR4 mRNA與顱動(dòng)脈狹窄程度和NIHSS評(píng)分的相關(guān)性

2.6 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

預(yù)后較好組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于預(yù)后不良組（P＜0.05）。見表7。

表7 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

表7 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 ±s

注：空白表示無此項(xiàng)。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA預(yù)后較好組 229 3.44±1.30 0.84±0.43預(yù)后不良組 95 6.30±2.21 1.76±0.64 t值 11.726 10.909 P值 0.000 0.000

2.7 HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后的價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后不良的最佳臨界值分別為4.364 ng/mL、0.989，曲線下面積（95%可信區(qū)間）分別為0.800（0.751～0.852）、0.815（0.754～0.860），敏感性分別為81.4%、85.1%，特異性分別為72.4%、73.5%。見圖1。

圖1 HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

ICVD主要由腦動(dòng)脈血栓形成導(dǎo)致，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。氧化應(yīng)激反應(yīng)可能在ICVD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因與ICVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[11]。HO-1作為細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵抗氧化酶，可通過降解血紅素來產(chǎn)生膽綠素、一氧化碳及鐵離子等，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步生成膽紅素。有研究結(jié)果顯示，HO-1、膽紅素及一氧化碳組成的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)在氧化應(yīng)激損傷及抗炎反應(yīng)中起重要作用[12]。膽紅素及膽綠素可抑制脂質(zhì)過氧化，清除體內(nèi)的活性氧。一氧化碳可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷區(qū)周圍的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和增殖，從而降低氧化應(yīng)激損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過上調(diào)HO-1表達(dá)可抑制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化，而抑制HO-1表達(dá)則可加重動(dòng)脈粥樣硬化[13]。還有研究結(jié)果顯示，HO-1對(duì)炎癥相關(guān)的腦損傷具有保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，ICVD患者血清HO-1水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致。原因可能是患者發(fā)生ICVD時(shí)，腦組織急性缺血缺氧，引發(fā)炎性介質(zhì)的大量釋放，從而誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的增加。

TLR是一類Ⅰ類跨膜受體，廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中，并被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中唯一一類可將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的跨膜蛋白[15]。TLR4是TLR分子家族中的一員，可與多種外源性或內(nèi)源性配體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要基礎(chǔ)之一。TLR可通過促進(jìn)炎癥因子，如白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α等的表達(dá)來調(diào)控血管內(nèi)皮炎性損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示，ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組（P=0.000），且顱動(dòng)脈狹窄或神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量越高，這提示TLR4及HO-1可能參與了ICVD的發(fā)生、發(fā)展。但本研究未對(duì)TLR4 mRNA及HO-1的變化機(jī)制進(jìn)行研究，TLR4及HO-1參與ICVD的上游、下游關(guān)鍵分子及具體機(jī)制仍有待深入研究。

本研究還探討了HO-1及TLR4 mRNA在ICVD患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。結(jié)果顯示，預(yù)后較好組HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于預(yù)后不良組（P＜0.05）。這表明TLR4及HO-1可作為評(píng)估患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。但本研究的隨訪時(shí)間僅為6個(gè)月，因此相關(guān)結(jié)論仍需樣本量更大、隨訪時(shí)間更長的研究結(jié)果加以驗(yàn)證。

綜上所述，ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，因此HO-1及TLR4或可作為ICVD患者病情評(píng)估及預(yù)后判斷的有效指標(biāo)。