朱勇琳， 王綠婭， 鄢盛愷

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029）

低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）是機(jī)體清除血漿低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的關(guān)鍵受體，在維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡方面具有重要作用[1-2]。LDLR基因突變可致多種脂代謝紊亂性疾病，最典型的是家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H），其最主要的臨床表現(xiàn)是低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高、黃色瘤、角膜弓和早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）。本文對(duì)LDLR基因突變和功能的檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期能為脂代謝異常及FH患者的早期篩查與診治提供新思路。

1 LDLR基因的結(jié)構(gòu)和功能

LDLR基因位于人類第19號(hào)染色體（p13.1-13.3），全長(zhǎng)45 kb，包含18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子。LDLR在肝臟中分布最多，主要功能是清除血漿LDL，維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡[1-2]。LDLR基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后分別受肝臟X受體（liver X receptor，LXR）和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9（proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9）的調(diào)控，同時(shí)也受轉(zhuǎn)錄因子膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol-regulatory element binding protein-2，SREBP-2）的調(diào)控[3-4]。LDLR與LDL在細(xì)胞表面結(jié)合成復(fù)合物并轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)體，釋放出LDL后又返回細(xì)胞膜繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。LDLR缺乏會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)LDL代謝受阻，繼而引發(fā)FH，這是開發(fā)他汀類藥物等調(diào)脂藥物的理論基礎(chǔ)。ABIFADEL等[5]發(fā)現(xiàn)，PCSK9可降解LDLR，進(jìn)而導(dǎo)致高膽固醇血癥，這為研制PCSK9抑制劑提供了思路。純合型家族性高膽固醇血癥（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）是由LDLR基因的雙等位基因突變引起的，危害更大，且他汀類藥物和PCSK9抑制劑對(duì)其治療效果有限。近年來，國外研發(fā)出的血管生成素樣蛋白3（angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3）抑制劑，具有不依賴LDLR降低血漿LDL-C的特點(diǎn)，可使HoFH患者的LDL-C降低50.9%～90.2%[6-7]。

2 LDLR基因突變的檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用

2.1 LDLR基因突變的檢測(cè)方法

LDLR基因突變的檢測(cè)以往多采用Southern印跡法、原位熒光雜交法、脈沖場(chǎng)凝膠電泳法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、變性梯度凝膠電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法[8]。近年來，Sanger測(cè)序（一代測(cè)序）、二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）和多重連接依賴性探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等技術(shù)成為檢測(cè)LDLR基因突變的主流方法，其優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用示例見表1[9]。LDLR基因突變的致病性可在LOVD、ClinVar和PubMed等數(shù)據(jù)庫中查詢[10]，如查詢不到，則可能為新的突變，可用Sorting Tolerant From Intolerant（SIFT）、PolyPhen-2、FruitFly、Dann和The Combined Annotation Dependent Depletion（CADD）等工具評(píng)估新突變的致病性及有害性[11-12]。

表1 3種常用LDLR基因突變檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用

2.2 LDLR基因突變檢測(cè)的臨床應(yīng)用

LDLR基因突變檢測(cè)是FH診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。目前報(bào)道的LDLR基因突變多達(dá)3 050個(gè)（來源于ClinVar數(shù)據(jù)庫），其中第4外顯子上的突變最為多見，突變頻率較高的位點(diǎn)有助于FH篩查[15]，部分突變的位點(diǎn)見圖1。LDLR基因致病性突變可致相應(yīng)的氨基酸結(jié)構(gòu)改變，并導(dǎo)致LDLR功能改變，從而影響膽固醇代謝及LDL的清除，最終引發(fā)FH，由其突變導(dǎo)致的FH病例，占所有報(bào)道病例的90%以上[14-15]。目前，F(xiàn)H的診斷率為28%～80%，單以臨床癥狀進(jìn)行診斷的效能有限，有90%以上的患者未得到有效的診斷和治療[15-16]。《家族性高膽固醇血癥篩查與診治中國專家共識(shí)》認(rèn)為FH的診斷應(yīng)結(jié)合臨床癥狀和基因檢測(cè)[14]。同時(shí)，也應(yīng)注意基因檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷之間可能存在不一致的情況[17]，特別是植物固醇血癥患者臨床癥狀與部分HoFH患者相似，可通過檢測(cè)血漿植物固醇水平及三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（adenosine triphosphatebinding cassette，ABC）G5或ABCG8基因突變加以鑒別[18]。

LDLR基因突變檢測(cè)也有助于評(píng)估ASCVD風(fēng)險(xiǎn)以及基因變異類型對(duì)ASCVD的影響程度。有研究發(fā)現(xiàn)，在同等LDL-C水平下，致病性突變攜帶者ASCVD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于非攜帶者[19]。TRINDER等[20]通過一項(xiàng)大樣本高膽固醇血癥隊(duì)列（277例單基因FH、379例多基因FH）評(píng)估基因變異對(duì)ASCVD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)遺傳因素增加ASCVD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)程度由強(qiáng)到弱依次為單基因變異FH患者、多基因變異FH患者、無變異患者。

圖1 部分LDLR基因突變位點(diǎn)與突變類型示意圖

此外，LDLR基因檢測(cè)還有助于血脂異?；颊叩闹委煕Q策與綜合管理。有研究發(fā)現(xiàn)，LDLR基因檢測(cè)對(duì)調(diào)脂治療的啟動(dòng)、依從性和更有效降低LDL-C等均有積極作用[16]。LDLR基因檢測(cè)可明確FH患者的基因型，不同基因型患者的預(yù)后不盡相同，且級(jí)聯(lián)篩查的模式和臨床治療方案的選擇也有很大差別，這有助于對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化精準(zhǔn)治療。未及時(shí)治療的FH患兒成年后發(fā)生冠狀動(dòng)脈事件的風(fēng)險(xiǎn)更高[21]，而兒童期被及時(shí)診斷和適當(dāng)治療的FH患兒預(yù)期壽命有望達(dá)到同齡兒童正常水平，經(jīng)明確診斷和適當(dāng)治療的成年FH患者也可顯著降低早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[22]。

3 LDLR功能的檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用

3.1 LDLR功能的檢測(cè)方法

LDLR的功能主要是清除血漿LDL[1]，研究整個(gè)LDLR周期（包括LDLR的表達(dá)和LDLR與LDL的結(jié)合）可全面反映LDLR的功能。目前，常用的方法包括熒光分析法和放射性分析法，2種方法的比較見表2。因熒光標(biāo)記LDL是一種更安全且等效的方法，所以放射性分析法正逐漸被熒光分析法取代[2，15]。檢測(cè)儀器主要有流式細(xì)胞儀（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）等。此外，體外細(xì)胞模型可用于研究LDLR基因突變、功能及致病機(jī)制，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞系CHO-ldlA7不表達(dá)內(nèi)在LDLR，是研究LDLR功能的優(yōu)秀模型[7]。

表2 熒光分析法和放射性分析法比較

3.1.1 熒光分析法 （1）熒光分析法檢測(cè)LDLR的表達(dá)主要有3種方法。第1種為抗體標(biāo)記法，用熒光標(biāo)記IgG-C7，利用FACS檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，可反映LDLR的表達(dá)量。IgG-C7是LDLR的單克隆抗體，可定量檢測(cè)LDLR的數(shù)量[23]；第2種為間接免疫熒光法，將LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細(xì)胞、LDLR抗體和熒光二抗共同孵育后，使用FACS定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度來反映LDLR的表達(dá)量[7]；第3種為免疫印跡法，將LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細(xì)胞、LDLR抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體和熒光二抗共同孵育后，量化LDLR蛋白的相對(duì)條帶強(qiáng)度，可用于半定量分析CHO-ldlA7細(xì)胞中成熟LDLR的表達(dá)量[15]。（2）熒光分析法檢測(cè)LDLR與LDL結(jié)合的能力主要有2種方法。第1種為FACS檢測(cè)法，用熒光標(biāo)記LDL，與LDLR抗體和熒光二抗共同孵育后，通過FACS測(cè)定熒光強(qiáng)度，總熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)細(xì)胞內(nèi)攝取LDL的量，可反映LDLR結(jié)合LDL的能力。加入臺(tái)盼藍(lán)，可抑制細(xì)胞外部熒光，能更準(zhǔn)確地檢測(cè)LDLR結(jié)合LDL的量[7，24]；第2種為CLSM檢測(cè)法，采用熒光標(biāo)記LDL，與LDLR基因突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-ldlA7細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過CLSM觀察LDLR與LDL的結(jié)合。使用CLSM和軟件分析能直觀地觀察細(xì)胞，并進(jìn)行圖像處理和熒光強(qiáng)度量化[7]。

3.1.2 放射性分析法 （1）LDLR表達(dá)的檢測(cè)。將125I標(biāo)記的IgG-C7與LDLR共同孵育，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞的放射性，可反映LDLR的表達(dá)量[23]。（2）LDLR與LDL結(jié)合能力的檢測(cè)。將125I標(biāo)記到LDL上，懸浮在肝素溶液中，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)肝素的放射性，可反映細(xì)胞內(nèi)LDLR結(jié)合125I-LDL的能力[25]。

3.2 LDLR功能檢測(cè)的臨床應(yīng)用

LDLR功能檢測(cè)有助于LDLR基因突變的分類。目前報(bào)道的LDLR基因突變中，僅有約15%的LDLR基因突變進(jìn)行了功能研究[15]。因沒有標(biāo)準(zhǔn)化的突變分類方法[26]，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)H患者中有約50%的相關(guān)突變歸為意義未知的突變[27]。只有當(dāng)突變對(duì)LDLR活性及LDL清除有影響時(shí)才會(huì)被定義為致病突變。LDLR基因突變分類是FH診斷的一部分，只有可能致病和致病突變是臨床診斷的依據(jù)。為了能更好地診治FH患者，根據(jù)LDLR功能來分類突變勢(shì)在必行[15]。

LDLR功能檢測(cè)有助于評(píng)估LDLR基因突變的致病性。不同類型的LDLR基因突變后受體活性為正常受體活性的2%～80%[7]，80%～100%是正常的受體活性，低于80%與受體活性降低（缺陷突變）相關(guān)，低于2%與沒有受體活性（“零”突變）相關(guān)[15]，活性越低后果越嚴(yán)重。在大多數(shù)FH類型中，LDLR基因突變會(huì)導(dǎo)致LDLR功能降低，但近期BJORNSSON等[28]報(bào)道的LDLR基因3′非翻譯區(qū)中的del2.5突變，是目前僅有的一處LDLR功能增益型突變。目前認(rèn)為，LDLR基因最嚴(yán)重的突變是位于第10外顯子上的（1448G＞A，p.Trp483X）突變，即第1448位堿基由G突變?yōu)锳，終止密碼子提前出現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯提前終止，導(dǎo)致氨基酸鏈縮短和蛋白質(zhì)分子不完全形成[29]。功能分析表明，W483X突變可導(dǎo)致LDLR結(jié)合活性降低17%，LDLR內(nèi)化活性降低39%，降低了LDLR清除體內(nèi)LDL的效率，這是我國南方FH患者和我國普通人群中最常見的致病突變[12，30]。

LDLR功能檢測(cè)有助于指導(dǎo)FH患者的治療。不同基因突變的FH患者治療方式不盡相同，隨著不同的調(diào)脂藥物的應(yīng)用，通過LDLR功能研究可了解LDLR活性及治療效果，有針對(duì)性地選用合適的藥物或其他方法進(jìn)行調(diào)脂治療，以降低ASCVD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，有助于FH患者的綜合管理[11，15]。如HoFH患者不能合成LDLR，對(duì)調(diào)脂藥物治療的反應(yīng)性不好，不經(jīng)治療在30歲之前就可能會(huì)發(fā)生心肌梗死；雜合型家族性高膽固醇血癥（heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）患者癥狀較輕，對(duì)調(diào)脂藥物表現(xiàn)出更好的治療反應(yīng)[30]。

4 展望

近年來，越來越多的國家開始重視FH，但因沒有公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)、適用于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)手段，加之臨床醫(yī)生認(rèn)知與重視度不夠等原因，導(dǎo)致不能及時(shí)、有效地篩查出LDLR基因的致病性突變，F(xiàn)H漏診嚴(yán)重，這一現(xiàn)象在發(fā)展中國家，特別是經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)尤為突出。同時(shí)，現(xiàn)有的用于治療FH的一線藥物也具有一定的局限性，如需聯(lián)合他汀類藥物與PCSK9抑制劑等昂貴藥物同時(shí)治療，常常導(dǎo)致有些FH患者單靠藥物治療并不能達(dá)到預(yù)期效果。因此，開發(fā)價(jià)廉、更快、更準(zhǔn)確、不需特殊設(shè)備且適用于基層實(shí)驗(yàn)室開展的檢測(cè)方法和商品化檢測(cè)試劑非常必要，有助于發(fā)現(xiàn)LDLR新的基因突變及潛在的調(diào)脂治療靶點(diǎn)，研制出療效更好的調(diào)脂藥物；也有助于早期高效篩查ASCVD及FH高危人群，以實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療。同時(shí)，還應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)臨床及全社會(huì)對(duì)FH的危害性和ASCVD早期干預(yù)重要性的認(rèn)識(shí)與關(guān)注，以幫助防治ASCVD。