任冬艷，李 磊，李翠平，孫潔宇，韓毅峰，閆繼彪

（內(nèi)蒙古普澤生物制品有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010080）

駱駝是我國西北和華北荒漠、半荒漠地區(qū)的重要畜種資源之一，也是這一地區(qū)草原畜牧業(yè)的重要組成部分。駝乳素有“沙漠白金”的美譽(yù)，作為一種營養(yǎng)價(jià)值較高的食物，駝乳雖然已經(jīng)得到了世界上多數(shù)國家的認(rèn)可，但是在日常生活中，人們對于駝乳依然并不熟悉，其食用并不廣泛。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)測定，駝乳中含有大量的維生素B、C 以及礦物元素，因此，駝乳以其豐富的營養(yǎng)被許多人們所青睞。由于駝乳越來越被人們所熟知，市場中駝乳的需求量增加，為游牧民族的人們帶來了新的收入增長點(diǎn)。

采用16S rRNA 基因序列方法對乳酸菌進(jìn)行分類，已經(jīng)成為當(dāng)今使用最多的方法[1]。研究微生物的種類有利于發(fā)掘生物多樣性、微生物類群多樣性、生態(tài)類型多樣性、遺傳多樣性[2]。本研究對采自內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)的駝奶樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，對菌種資源的挖掘和保護(hù)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 駝奶樣品來源

新鮮駝奶樣品采自內(nèi)蒙古阿拉善牧民家庭。將樣品置于無菌容器內(nèi)，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 液體培養(yǎng)基、M17 固體培養(yǎng)基、M17 液體培養(yǎng)基，由深市環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

試劑：PBS 緩沖液、脫脂乳保護(hù)劑、細(xì)菌DNA提取試劑盒PCR 擴(kuò)增和電泳所用試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品收集

收集樣品采用直接取樣法。采集樣品并對樣品進(jìn)行編號標(biāo)注，于4 ℃便攜式冰箱內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室待研究。

1.2.2 樣品分離

結(jié)合乳酸菌的特性選擇較為合理的分離方法，根據(jù)相關(guān)理論可知，涂布法是較為合適的方法[3]。取駝乳加生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后吸取0.2 mL 合適的稀釋液分別涂在兩種固體培養(yǎng)基上，然后將涂有固體培養(yǎng)基的平板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)48 h。菌落形成后，隨機(jī)挑取出形態(tài)特征不同的革蘭氏染色陽性單個菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，如此反復(fù)純化3～4 次，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中增殖，進(jìn)行純化培養(yǎng)[4]。對純化好的菌液進(jìn)行保藏。

1.2.3 基因組DNA 提取及16S rRNA 基因的PCR擴(kuò)增

用TIANampBacteria DNA Kit 提取基因組DNA，用ND-2000C 微量紫外分光光度計(jì)測其濃度和OD260/280 值。

PCR 擴(kuò)增體系：5 μL Easy Taq Buffer（Mg2+）；4 μL High Pure d NTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物FA-27F（濃度為10 mmol/L）；1.5 μL 引 物RA-1495R（濃 度10 mmol/L）；0.5 μL Easy Taq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模 板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）；35.5 μL H2O。PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物[5]。

PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min。

1.2.4 16S rRNA 序列測定和同源性分析

將PCR 產(chǎn)物送到派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，運(yùn)用DNAStar 6.1 軟件包中的SeqMan 軟件將其進(jìn)行拼接，最終獲得1 400 bp 的有效序列。利用Blast 軟件將測定的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知分類地位的乳酸菌基因序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用軟件Mega 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離株的菌落形態(tài)

根據(jù)菌落的形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果和過氧化氫酶試驗(yàn)，將從駝奶中分離到的7 株菌株初步定為乳酸菌。在固體培養(yǎng)基上菌落形狀呈圓形，中心凸起，邊緣整齊，表面光滑或者粗糙，顏色為白色或乳白色。

2.2 乳酸菌基因提取結(jié)果和16S rDNA 的擴(kuò)增結(jié)果

由圖1 可知，用微量紫外分光光度計(jì)測定提取得到乳酸菌菌株基因組DNA，所有分離株DNA 的純度值（A260/A280）都 在1.8～2.0，濃度范圍在100～3 000 ng/μL，分離株基因組DNA 是滿足后續(xù)試驗(yàn)要求的。由于不存在非特異性擴(kuò)增，因此可以判斷菌株16S rDNA 符合條件，可以進(jìn)行后續(xù)的操作，即送到指定單位進(jìn)行純化以及測序。

圖1 16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 同源性分析

由圖2 所示，菌株T2、T9 和T12 與模式株Lactococcus lactisATCC 19435 聚在一起，同源性為99%，可歸為Lactococcus lactis。T4 和T10 與模式株Enterococcus gilvus ATCC BAA-350 聚類，同源性為97%，可歸為Enterococcus gilvus。T5 和模式株Lactobacillus paracaseiATCC 25302（D79212）聚類，同源性為99%，可歸為Lactobacillus paracasei。T8 和模式株Leuconostoc mesenteroidesNCFB529聚 類，同源性為98%，故鑒定為Leuconostoc mesenteroides。

圖2 駝奶分離株的16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究從駝奶中分離出的乳酸菌一共有7 株，經(jīng)過一系列的分析以及測定可以判斷這7 株乳酸菌為3 個 屬4 個 種，包 括2 株Enterococcus gilvus，1 株Lactobacillus paracasei，1 株Leuconostoc mesenteroides，3 株Lactococcus lactis，該樣品多樣性較為豐富，Lactococcus lactis為優(yōu)勢菌種。