孫弋雅，周方圓，周明玉，劉海月，王大為，劉英姿

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是最早在19世紀(jì)末由Friendiander發(fā)現(xiàn)，它屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬，廣泛存在于水和土壤中，近年來(lái)成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件性致病菌，可以感染人類及各種動(dòng)物。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)在全身各個(gè)部位可發(fā)生感染[1]，除了最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)感染，還可引發(fā)肝膿腫、腦膿腫、腦膜炎、眼炎等疾病[2]。近些年，由于抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌的耐藥越來(lái)越嚴(yán)重，所以，本病不僅多發(fā)而且敏感藥物越來(lái)越少[3-4]。目前針對(duì)該菌的致病因子和耐藥性的研究已有一些報(bào)道，但關(guān)于其致病力、親緣關(guān)系、耐藥性的關(guān)系研究還不多見(jiàn)，因此，本研究針對(duì)臨床不同病例來(lái)源肺炎克雷伯菌，開(kāi)展致病性及其遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，為探索肺炎克雷伯菌的傳播來(lái)源和致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

選取錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院發(fā)熱患者、硫化氫中毒患者、腦梗死患者、腦血管病患者及膽腸吻合口結(jié)石患者病例的檢驗(yàn)樣品，檢驗(yàn)科通過(guò)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)得到5株疑似肺炎克雷伯菌，菌株編號(hào)、來(lái)源與科室見(jiàn)表1。

表1 菌株編號(hào)及來(lái)源

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠42只，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；3日齡海蘭褐健康雛雞42只，購(gòu)自錦州某雞白痢凈化種雞場(chǎng)，經(jīng)過(guò)常規(guī)細(xì)菌學(xué)和常見(jiàn)病毒核酸檢測(cè)呈陰性，飼養(yǎng)于獸醫(yī)樓小動(dòng)物飼養(yǎng)室，環(huán)境溫濕度條件和飼料營(yíng)養(yǎng)按照雛雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 主要儀器試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、革蘭氏染色液(青島海博生物技術(shù)有限公司)；陰性細(xì)菌鑒定卡、0.45% NaCl溶液(法國(guó)BIOMERIEUX公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒(杭州博日科技有限公司)；DM2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Gill green核酸染料(華越洋生物科技有限公司)；VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離純化、觀察及生化試驗(yàn)：按常規(guī)微生物檢驗(yàn)方法，應(yīng)用普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基對(duì)檢驗(yàn)樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和純化。選取疑似菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察形態(tài)。對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行保種，使用無(wú)菌棉拭沾取3～5個(gè)菌落，接種到菌落凍存管中，放入冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆?。生化試?yàn)采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定，具體方法步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2 細(xì)菌16S rRNA的PCR檢測(cè)及其序列遺傳進(jìn)化關(guān)系分析：按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作提取分離純化后的細(xì)菌基因組DNA，使用16S rRNA通用引物(由上海生工生物公司合成)進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，引物序列為：27F：5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1492R：5’ TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’。PCR反應(yīng)總體積為30 μL，2×Taq Master Mix緩沖液15 μL，DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)符合目的大小的片段進(jìn)行凝膠回收，并送至上海生工生物公司測(cè)序。使用比對(duì)軟件DNAMAN(Version 9)、MEGA 5.0等與標(biāo)準(zhǔn)肺炎克雷伯菌序列進(jìn)行比對(duì)分析，并對(duì)所分離的5株菌株以及部分動(dòng)物源菌株進(jìn)行同源性分析，繪制進(jìn)化樹。

1.4.3 致病性試驗(yàn)

1.4.3.1 接種菌液的制備：選取本實(shí)驗(yàn)鑒定純化的肺炎克雷伯菌5株，編號(hào)為KP1、KP2、KP3、KP4、KP5復(fù)蘇培養(yǎng)，使用滅菌后的鑷子夾取一個(gè)磁珠放入無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 160 rpm培養(yǎng)。待菌液渾濁后，用校正后的麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5×108CFU/mL)，吸取一定菌液至滅菌后的EP管中，10 000 rpm離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌PBS溶液重懸沉淀，重復(fù)3次，最后用PBS制成菌懸液備用。

1.4.3.2 致病性試驗(yàn)：分別將42只小鼠和雛雞隨機(jī)分為7組，分別為感染組(KP1～KP5組)、空白對(duì)照組和健康對(duì)照組，分籠隔離飼養(yǎng)。小鼠和雛雞感染組每只腹腔分別注射0.3 mL和0.5 mL菌懸液，空白對(duì)照組分別注射0.3 mL和0.5 mL無(wú)菌PBS溶液，健康對(duì)照組不作處理。接種后分別在相同環(huán)境下隔離飼養(yǎng)，記錄小鼠和雛雞臨床癥狀、死亡情況；對(duì)所有小鼠和雛雞進(jìn)行剖檢并觀察各器官病理變化，同時(shí)采集組織樣本進(jìn)行病理組織切片制作，觀察病理組織學(xué)變化。無(wú)菌采集肝臟、脾臟、腎臟等發(fā)病器官，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查。

1.4.4 藥物敏感性試驗(yàn)：使用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行菌株的藥敏試驗(yàn)，具體方法按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理，應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行卡方分析，以P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

5株分離菌株編號(hào)為KP1、KP2、KP3、KP4、KP5，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為中等大小、光滑、具有黏性的乳白色菌落。當(dāng)菌落距離近時(shí)，可相互融合成為菌苔，見(jiàn)圖1A；在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、光滑、圓凸的粉紅色菌落，見(jiàn)圖1B；革蘭氏染色后，在顯微鏡下可觀察到菌株呈革蘭氏陰性，兩邊鈍圓的短粗桿菌，單個(gè)或雙鏈存在，見(jiàn)圖1C。

圖1 肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果顯示，5株分離菌株均屬于肺炎克雷伯菌肺炎亞種，與肺炎克雷伯菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)相似度為99%以上，分離菌株dGLU、dMAL、dMAN、dMNE均為陽(yáng)性，5株分離菌株的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合肺炎克雷伯菌生化試驗(yàn)特性。

2.3 細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果及序列遺傳進(jìn)化關(guān)系分析

分離純化后的菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳后，在1450 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與目的大小相符，見(jiàn)圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后拼接得到目的序列，不同分離菌株經(jīng)Blast比對(duì)與肺炎克雷伯菌同源性高于99%，即確定5株細(xì)菌均為肺炎克雷伯菌。不同分離菌株同源性比對(duì)結(jié)果顯示KP1～KP4同源性為98.85%，其中KP1&KP2&KP4同源性高達(dá)99.56%，KP1～KP5同源性為93.42%；遺傳進(jìn)化樹結(jié)果同樣證明KP1～KP4親緣關(guān)系較近，KP1-KP4與KP5親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，見(jiàn)圖3。

M：DM2000 marker；1-5：檢測(cè)樣本；6：陰性對(duì)照

圖3 KP1～KP5遺傳進(jìn)化樹

2.4 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)1 w觀察小鼠和雛雞的狀態(tài)，見(jiàn)表2。小鼠和雛雞感染組(KP1～KP5)均有發(fā)病，發(fā)病率為100%，死亡率在50%～100%不等；KP3腦梗死病例分離菌株致死率最高為100%，顯著高于其它各組(P≤0.01)；KP5膽腸吻合口結(jié)石病例分離菌株致死率最低僅為50%，雛雞KP1組死亡率介于中等水平為83.3%。健康組和空白對(duì)照組小鼠和雛雞均未發(fā)病。小鼠和雛雞感染組細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性率為100%。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為飲食飲水量下降、聚堆、行走困難、眼角有黃色分泌物、四肢末端充血、肛門有糞便黏住、皮下充血水腫、見(jiàn)圖4。主要剖檢變化為：肺臟充血淤血，肝臟淤血變性，腎臟出血變性，脾臟出血壞死，腦實(shí)質(zhì)充血，見(jiàn)圖5。發(fā)病雛雞典型癥狀表現(xiàn)為飲食飲水量下降，畏寒，聚堆，鼻腔和嘴有黃色透明液體分泌，四肢末端充血，見(jiàn)圖6。典型剖檢變化肺臟充血淤血，肝臟變性壞死，白細(xì)胞滲出，包膜纖維素性炎癥，腎臟出血變性，脾臟出血壞死，腦膜下白細(xì)胞滲出，見(jiàn)圖7。

圖4 KP1～KP5組發(fā)病組小鼠典型臨床癥狀

A：肺臟充血淤血；B：肝臟淤血變性；C：腎臟出血變性；D：脾臟出血壞死；E：腦實(shí)質(zhì)充血

圖6 KP1～KP5組發(fā)病組雛雞典型臨床癥狀

A：肺臟充血淤血；B：肝臟變性壞死；C:腎臟出血變性；D:脾臟出血壞死；E：腦膜下白細(xì)胞滲出

表2 小鼠和雛雞致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)不同病例來(lái)源所分離的5株肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中KP3和KP5兩株為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌，KP2、KP3和KP5表現(xiàn)出多重耐藥性，KP1和KP4較少表現(xiàn)出耐藥性，見(jiàn)表3。

表3 5株肺炎克雷伯菌分離菌藥敏結(jié)果

3 討 論

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，肺炎克雷伯菌主要通過(guò)莢膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、菌毛、鐵載體系統(tǒng)和外膜蛋白、孔蛋白、尿囊素代謝等致病因子導(dǎo)致人和動(dòng)物發(fā)病。在營(yíng)養(yǎng)不良和各種疾病導(dǎo)致免疫功能低下時(shí)引起呼吸道感染、肺炎、泌尿系感染、肝膿腫、眼內(nèi)炎、腦膿腫等多種病癥。以小鼠為動(dòng)物模型開(kāi)展肺炎克雷伯菌致病性的研究較多[5-6]，但鮮有對(duì)不同病例來(lái)源菌株的致病力差異及其親緣關(guān)系的研究報(bào)道；有大量文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于不同哺乳動(dòng)物和禽類來(lái)源肺炎克雷伯菌分離鑒定和致病性的研究，而未見(jiàn)有針對(duì)小鼠以外的其它動(dòng)物開(kāi)展人源肺炎克雷伯菌致病性研究。因此，本研究從錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院采集感染科發(fā)熱患者、重癥監(jiān)控科硫化氫中毒患者、神經(jīng)內(nèi)科腦梗死患者、重癥監(jiān)控科腦血管病患者及膽腸吻合口結(jié)石患者不同來(lái)源的病例樣品，成功分離鑒定到5株肺炎克雷伯菌，分別以小鼠和雛雞為模型對(duì)其致病性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，5株不同病例來(lái)源菌株均可引起小鼠和雛雞100%的發(fā)病率，死亡率也高達(dá)50%～100%。其中腦梗死病例分離菌株致死率最高為100%，膽腸吻合口結(jié)石病例分離菌株致死率最低為50%?；疾⌒∈蠛碗r雞表現(xiàn)的典型癥狀相似，均表現(xiàn)為飲食飲水量下降、聚堆、行走困難、眼角有黃色分泌物，四肢末端充血；且典型病理剖檢變化均為肺臟、肝臟、脾臟、腦充血出血，雛雞還可見(jiàn)肝包膜纖維素性炎癥。研究結(jié)果一方面說(shuō)明不同病例來(lái)源肺炎克雷伯菌的致病性存在明顯差異，但為什么腦梗死病例來(lái)源菌株致病力最強(qiáng)還需要擴(kuò)大樣本并進(jìn)行深入研究。另一方面，說(shuō)明不同病例來(lái)源肺炎克雷伯菌對(duì)小鼠和禽類均具有致病性，即說(shuō)明該菌可通過(guò)鼠類和禽類進(jìn)行疾病傳播，因此在防控過(guò)程中必須重視對(duì)鼠類和禽類傳播途徑的控制。此外還可應(yīng)用小鼠和禽類作為多種病例來(lái)源肺炎克雷伯菌的動(dòng)物模型，以此開(kāi)展致病機(jī)制、耐藥性、新藥開(kāi)發(fā)等研究。

本研究顯示，不同病例來(lái)源的分離菌株親緣關(guān)系有明顯差異，來(lái)源于感染科發(fā)熱KP1、重癥監(jiān)控科硫化氫中毒KP2、神經(jīng)內(nèi)科腦梗死KP3、重癥監(jiān)控科腦血管病KP4的菌株同源性較高，為98.85%，尤其是KP1、KP2、KP4同源性為99.56%，但KP1-KP5同源性為93.42%，說(shuō)明KP1-KP4與膽腸吻合口結(jié)石KP5親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而KP1-KP4均為腸道系統(tǒng)以外的器官病例，可能均為肺炎克雷伯菌繼發(fā)感染，是否存在院內(nèi)感染的情況需要深入研究；而膽腸吻合口結(jié)石病例KP5為單獨(dú)分支來(lái)源，是否與腸道系統(tǒng)微生物菌群有關(guān)也有待深入研究。綜合致病性差異結(jié)果，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和致病性不完全成正相關(guān)，同源性較高但不同菌株也可能有較大的致病性差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株致病性不一定存在明顯差異。

克雷伯菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重且存在地區(qū)和時(shí)空的差異性[7-8]，本研究結(jié)果表明，不同病例來(lái)源肺炎克雷伯菌的耐藥性存在較大差異，在5株不同病例來(lái)源所分離的肺炎克雷伯菌中神經(jīng)內(nèi)科腦梗死KP3和KP5兩種菌株為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌，KP2、KP3和KP5 3種菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，KP1和KP4兩種菌株表現(xiàn)耐藥性較少。結(jié)合上述致病性和親緣關(guān)系研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)耐藥性與致病性和親緣關(guān)系沒(méi)有必然聯(lián)系，與何紅、陳娜、宋曉超等研究結(jié)果一致[9-12]。雖然有許多關(guān)于耐藥性與毒力因子之間的關(guān)系研究[13-15]，但其必然聯(lián)系仍不明確，因此，針對(duì)肺炎克雷伯菌的同源性、血清型、毒力因子、致病力、耐藥性及耐藥基因以及與感染病例免疫指標(biāo)、血液生化指標(biāo)等之間的聯(lián)系均需要進(jìn)一步研究。