李 梨

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 重慶 400010)

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一種來源于中胚層的、早期未分化的細(xì)胞，廣泛地分布于人體各個細(xì)胞組織中，可實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制、自我更新和無限增殖，還具有實(shí)現(xiàn)多向細(xì)胞分化的巨大潛能[1]。MSCs可通過分泌細(xì)胞因子等方式來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)干細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組織器官修復(fù)。先前的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞對血液系統(tǒng)疾病、血管性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、退行性疾病、腫瘤性疾病、移植物抗宿主病的治療具有潛在價(jià)值[2][3][4]。

外泌體（exosomes）是一種圓形或橢圓形的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約為30～150nm，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)/多肽、mRNA、microRNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA以及完整的細(xì)胞器等多種成分[5]。外泌體廣泛存在于人體尿液、血漿、唾液、母乳、腦脊液、羊水、腹腔積液等多種不同體液中，由造血/非造血細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，包括血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、胃腸黏膜上皮的白細(xì)胞、樹突狀上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞等[6]。外泌體包括9769種來源蛋白質(zhì)，3408種mrnas及838種microrna(mirnas/mirs)[7]，參與了機(jī)體中許多重要的生理生化過程，在細(xì)胞通信、遷移、血管新生、自身免疫反應(yīng)及惡性腫瘤細(xì)胞的生長中都起著重要作用[8][9]。

間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體（MSCs-exo）與MSCs的功能相似，具有修復(fù)組織、組織再生、抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫等功能，可用于治療心臟、腎臟、肝臟、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[5][10][11]。不同組織來源的MSCs-exo具有不同的作用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可應(yīng)用于減輕心肌缺血、抑制肝臟分化、抗腫瘤、促進(jìn)皮膚愈合、促進(jìn)受損腎神經(jīng)的修復(fù)等多種疾病的動物模型[10]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可以表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白CD9及CD63，能夠通過上調(diào)Treg和下調(diào)Th17參與自身免疫功能調(diào)節(jié)[12][13]。

肝臟被認(rèn)為是我們身體最大的以其代謝和消化功能活動為主的一種實(shí)質(zhì)性器官,具有儲存肝糖、生物轉(zhuǎn)化、合成分泌性蛋白、合成凝血因子、內(nèi)分泌及免疫調(diào)節(jié)等功能。急性肝衰竭、肝硬化甚至肝癌等急慢性肝臟疾病嚴(yán)重影響人們的生命健康，提高肝臟在受傷后的修復(fù)能力是近年來研究的熱門話題。本文將對間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體對肝臟病變的影響進(jìn)行綜述。

一、間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體與急性肝損傷

急性肝衰竭（ALF）是一種死亡率極高的疾病，其特征表現(xiàn)是“炎癥因子風(fēng)暴”，通過TNF-α、IL-1和IL-6等促炎因子的釋放，從而引起全身炎癥反應(yīng)，最終引起多器官功能衰竭[14]。受損的細(xì)胞可產(chǎn)生多種炎性刺激物，導(dǎo)致caspase-1激活，活化的caspase-1剪切并激活pro-IL-1b，最終導(dǎo)致蛋白水解活化；此外，肝細(xì)胞損傷后，促凋亡蛋白Bax和caspase3表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)[15][16]。Zhao, Liu等[17]通過建立一個D-半乳糖胺和脂多糖（D-GalN/LPS）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和凋亡的模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過BMSC-Exos處理后，Bax和caspase-3的表達(dá)水平顯著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。但是，當(dāng)存在自噬抑制劑3MA時(shí)，BMSC-Exos對細(xì)胞凋亡的抑制作用會發(fā)生比較明顯的逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，BMSC-Exos可以誘導(dǎo)自噬，并通過介導(dǎo)自噬保護(hù)肝細(xì)胞免受各種應(yīng)激損傷。另一項(xiàng)研究使用LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠作為ALF的模型[12]。在LPS/D-GalN模型中，D-GalN具有肝毒性作用，而LPS通常與Toll樣受體4（TLR4）/CD14復(fù)合物結(jié)合，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，引起大量巨噬細(xì)胞的浸潤。結(jié)果顯示hUC MSC-Exos降低了LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1b和IL-6的表達(dá)。由此得出hUC MSC-Exos可降低NLRP3炎癥小體的過度活化，在急性肝衰竭小鼠模型中起保護(hù)作用。Shao, Xu等[18]通過使用IL-6刺激hUC-MSCs，并對hUC-MSC來源的外泌體進(jìn)行深度測序，確定miR-455-3p在IL-6刺激下由hUC MSC-Exos分泌產(chǎn)生，通過靶向PIK3r1抑制巨噬細(xì)胞釋放IL-6和其他炎癥因子。在化學(xué)性肝損傷小鼠模型中，miR-455-3p的高表達(dá)可減輕巨噬細(xì)胞浸潤和局部肝損傷，降低血清炎癥因子水平，從而改善肝臟組織病理損傷。有研究者通過醋氨酚（APAP）和過氧化氫（H2O2）體外誘導(dǎo)肝損傷[19]。APAP主要通過生成N-乙酰基-p-苯并喹非亞胺（NAPKI）并與肝蛋白的結(jié)合來介導(dǎo)肝損傷，而H2O2僅通過氧化應(yīng)激途徑誘發(fā)肝損傷。兩者均可引起線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在兩種損傷模型中，外泌體治療組的細(xì)胞活力顯著提高。結(jié)果表明，在肝再生過程中，啟動期基因的上調(diào)可導(dǎo)致外泌體中增殖蛋白，如PCNA和cyclind1的高表達(dá)。此外，外泌體還可通過上調(diào)Bcl-xL蛋白抑制APAP-和H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，但是外泌體不能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激減輕肝細(xì)胞損傷。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體與自身免疫性肝炎

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝臟炎癥性疾病，其確切病理生理機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究表明，多種間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體含有TGF-β1、IL-6、IL-10和肝細(xì)胞生長因子（HGF）等細(xì)胞因子和生長因子，有助于免疫調(diào)節(jié)[20]。其中，IL-6可以促進(jìn)幼稚T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，分泌IL-17，促進(jìn)AIH的發(fā)展。IL-1β可以將人Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，Treg細(xì)胞可分泌IL-10，以維持肝臟免疫平衡和IL-10的耐受性[21]。miRNA-223-3p是PBMC和BMSC中高表達(dá)的miRNA，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因STAT3的表達(dá)，該基因是IL-1β和IL-6的重要上游激活因子，Treg和Th17細(xì)胞及其分泌的IL-10和IL17在AIH模型中增加。此外，STAT3還可激活RORT并促進(jìn)Th17細(xì)胞中IL-17的分泌，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。hUC MSC-Exos可作為載體將micro-RNA傳遞到細(xì)胞中，調(diào)節(jié)肝臟中IL-1β和IL-6的表達(dá)。Lu等[22]通過改變肝臟S100/CFA-小鼠脾臟中Treg和Th17細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)攜帶miRNA-223-3p的間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體顯著提高了Treg/Th17的降低比率。其機(jī)制與miRNA-223-3p介導(dǎo)的對STAT3基因和炎性細(xì)胞因子（IL-1β和IL-6）表達(dá)的調(diào)節(jié)以及Treg/Th17比值的升高有關(guān)。其中，NLRP3屬于炎性復(fù)合體的傳感蛋白，異常NLRP3激活可能參與了自身免疫性疾病的進(jìn)展。caspase-1可分泌促炎細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，通過激活caspase-1，然后分泌IL-1β對內(nèi)源性或外源性危險(xiǎn)信號做出應(yīng)答。Chen等[23]采用肝抗原S100建立小鼠自身免疫性肝炎模型，用LPS和ATP建立肝細(xì)胞細(xì)胞損傷模型，采用超速離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，通過血清ALT和AST的水平以及肝組織學(xué)來評估肝損傷，用炎癥性細(xì)胞因子和乳酸酶脫氫酶分別檢測炎癥和細(xì)胞死亡。研究表明間，充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可通過miRNA-233途徑來調(diào)控炎癥小體NLRP3及caspase-1，通過與其3’-UTR結(jié)合抑制NLRP3的激活，導(dǎo)致NLRP3 mRNA降解，從而抑制肝臟炎癥和細(xì)胞死亡。

三、間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體與肝纖維化/肝硬化

肝星狀細(xì)胞（HSCs）通過細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)激活，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。細(xì)胞外基質(zhì)在增殖的HSCs協(xié)助下通過分泌膠原形成纖維瘢痕組織，但如果不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，則可導(dǎo)致肝硬化。損傷的上皮細(xì)胞釋放的外泌體可促進(jìn)a-SMA表達(dá)、F-actin表達(dá)、成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，成纖維細(xì)胞的活化依賴于外泌體中TGF-b1 mRNA的傳遞。TGF-β1在STAT3激活的HSCs中才具有促纖維化細(xì)胞因子和凋亡特性，此外，STAT3還可介導(dǎo)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄。通過建立HST-T6或CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-181-5p可通過修飾STAT3和Bcl-2的3’UTR，減弱STAT3和Bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)通過下調(diào)STAT3通路介導(dǎo)TGF-β1信號傳導(dǎo)，減輕肝組織纖維化程度[24][25]。Li[13]等研究者用四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化，通過肝臟內(nèi)直接注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex移植到小鼠纖維化肝臟后血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性增加，而Ⅰ型和Ⅲ型膠原降低，并通過作用于TGF-β1和磷酸化Smad2在體內(nèi)的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞損傷的恢復(fù)。另一項(xiàng)研究建立了CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，注射hBM-MSCs-Ex治療4周[26]。研究結(jié)果表明，體內(nèi)注射hBM-MSCs-Ex可通過減少膠原蛋白沉積，增強(qiáng)肝功能，抑制炎癥和促進(jìn)肝細(xì)胞再生減輕肝纖維化。此外，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，hBM-MSCs-Ex在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均抑制Wnt/β-catenin通路，α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)。

四、間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體與肝癌

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因，其發(fā)病機(jī)理及治療的研究一直是肝癌研究的重點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AMSC-Exo-199a具有典型的外泌體特性，可通過抑制其靶基因YAP1、CD151和mTOR的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和遷移減少，從而增強(qiáng)阿霉素的敏感性。此外，靜脈注射AMSC-Exo-199a可顯著增強(qiáng)Dox在體內(nèi)抗HCC的作用。除mTOR外，HK2、PKM2、PAK4等MiR-199a-3p介導(dǎo)的基因調(diào)控也被證明與肝癌有關(guān)[27]。另一項(xiàng)研究評估了來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和肝間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝癌進(jìn)展的潛在影響及其相關(guān)機(jī)制[28]。CSCs源性外泌體組小鼠的肝臟相對重量和血清腫瘤標(biāo)志物和肝酶水平、HCC標(biāo)志物、免疫染色強(qiáng)度、腫瘤的數(shù)量和面積均顯著增加。表明CSCs源性外泌體具有顯著的誘導(dǎo)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成的能力，可導(dǎo)致顯著的腫瘤生長和進(jìn)展。此外，CSCs外泌體增加了Bcl2、TGFβ1、NFκB、MMP9和VEGF基因的表達(dá)；增加了TGF-β1、P13K和ERK蛋白的表達(dá)；增加了PCNA的免疫染色；增加了血清TGF-β1的水平，但降低了Bax、p53和timp1 mRNA的水平。

五、間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體與其他肝臟疾病

大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和臨床資料研究結(jié)果表明，酒精性肝病患者住院人數(shù)占同期全國肝病患者的比例逐年上升。研究顯示，活性氧（ROS）在酒精性肝病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。ROS可激活NLRP3-caspase-1信號通路，介導(dǎo)相關(guān)促炎細(xì)胞因子（如IL-1β）釋放[29]。此外，Treg/Th17比例的失衡也參與ALD的發(fā)生、發(fā)展。jin等[30]通過建立一個酒精性肝損害小鼠模型，分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體，在ald小鼠中進(jìn)行MSCs-exo植入，最終發(fā)現(xiàn)MSCs-exo能夠減輕由于乙醇引起的肝損害和脂質(zhì)沉淀。具體的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Nrf-2/HO-1和NLRP3-caspase-1-IL-1β通路、恢復(fù)Treg和TH17細(xì)胞的比例平衡，最終降低肝內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥水平。

六、總結(jié)與展望

本文通過分析間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在自身免疫型肝炎、急性肝衰竭、肝硬化、肝癌等疾病中的功能與作用機(jī)制并做出簡要的總結(jié)，為肝臟疾病的診斷和新藥的研發(fā)工作提供了一種嶄新的方法與思路。但目前的研究僅建立在小鼠模型的基礎(chǔ)上，MSCs-exo用于治療靈長類動物的效果仍然還有待考量，且關(guān)于MSCs-exo仍存在一些健康安全問題，但它在急慢性肝臟疾病的治療上仍然具備很大的潛力，將MSCs-exo廣泛地應(yīng)用到肝臟疾病的臨床診斷和治療、改善疾病的預(yù)后等，都是我們目前研究工作中的重點(diǎn)，具有十分重要的意義。