趙丹，劉坤，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學與技術(shù)學院，大慶 163319）

隨著科技的不斷進步，微型機械在生物醫(yī)學、航空航天、國防航海等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是構(gòu)成微型機器人、微型工具、微型飛機等微型機械的基本單元[1]。機械加工可以用來在工件上添加、去除或塑造材料的形狀。根據(jù)所使用的能量種類，用于去除材料的加工過程可以分為物理、化學和生物[2]。傳統(tǒng)機械加工在加工微小零件時，容易產(chǎn)生變形、發(fā)熱等問題，不能精確地控制其精度。生物加工是一種可控的微生物過程，通過金屬去除或溶解在工件上選擇性地形成微結(jié)構(gòu)[3]。微生物活動不會產(chǎn)生太多熱量或殘余應(yīng)力，利用微生物代謝過程中一些復(fù)雜的生化反應(yīng)來去除待加工基體上的多余材料，將微生物作為微小的“刀具”加工出精細結(jié)構(gòu)保證了精度，高質(zhì)量，并避免扭曲或損壞工件[4]。氧化亞鐵硫桿菌是一種化能自養(yǎng)菌，以還原態(tài)的硫及亞鐵為能源，專性好氧，嗜酸性，廣泛生活在金屬硫化礦和煤礦的酸性礦坑水中。研究表明氧化亞鐵硫桿菌可以對紫銅表面的微細圖形進行選擇加工，得到具有清晰齒輪輪廓結(jié)構(gòu)的圖形[4]。中國科學院和北京航空航天大學合作，制作出了微小齒輪和微小溝槽[5]。

然而微生物生長繁殖至衰亡期時，細菌的活性逐漸降低，還需要再次對其進行氧化培養(yǎng)，且菌液的批次更替造成大量微生物損失，降低了加工效率。固定化微生物在工業(yè)應(yīng)用中具有效率高，耗能低，可多次利用的優(yōu)點[6]。因此研究了通過固定化方法來增大細胞密度，使反應(yīng)加速，實現(xiàn)連續(xù)化操作，以提高生物刻蝕速度。研究表明氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans）和氧化硫硫桿菌（A.thiooxidans）2種菌株混合組成的混合腐蝕菌，可在含F(xiàn)e2+和硫代硫酸鈉的雙底物培養(yǎng)基中正常生長[7]，且已驗證鐵硫混合腐蝕菌系在傳代過程中組成和功能都較為穩(wěn)定[8]。

常用的細胞固定化方法有包埋法、交聯(lián)法、吸附法、自絮凝法、載體結(jié)合法[9]。其中吸附法微生物與載體結(jié)合能力弱，易受環(huán)境影響；自絮凝法生成機械強度差，大小不均勻；載體結(jié)合法反應(yīng)條件劇烈，環(huán)境控制嚴苛[10]。包埋法在微生物固定化有條件溫和，操作簡單穩(wěn)定性好的優(yōu)點[11]。常用的載體材料有海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、明膠、卡拉膠等[12]。海藻酸鈉微球在多次利用后機械強度下降，有溶解現(xiàn)象[13]；聚丙烯酰胺對生物有毒性；明膠生成微球有粘連現(xiàn)象[14]，亞鐵氧化率無法達到工業(yè)要求?；旌细g菌系雙底物培養(yǎng)基為強酸性、高離子濃度，海藻酸鈉、卡拉膠、明膠微球維持穩(wěn)定性困難。聚乙烯醇有較好的機械強度和無毒性是一種良好的微生物包埋材料。在聚乙烯醇中加入少量海藻酸鈉能抑制微球在交聯(lián)劑中的粘連[15]，運用硝酸鈣代替?zhèn)鹘y(tǒng)的氯化鈣作交聯(lián)劑能提高氧化亞鐵硫桿菌的生物活性[16]。優(yōu)化和改進細胞固定化條件能夠更好的發(fā)揮微生物的能力，響應(yīng)面法是一種較好的實驗優(yōu)化的方法，因其具有實驗次數(shù)少，實驗精度高的特點而在生物實驗中廣泛應(yīng)用[17]。實驗前期探究了溫度（20~40℃）、培養(yǎng)時間（0~72 h）、培養(yǎng)液pH（1.50~2.50）、裝液量（10%~60%）、接種量（0~20%）、交聯(lián)時間（45~75 min）、交聯(lián)轉(zhuǎn)速（80~160 rpm）、Ca（NO3）2濃度（1%~5%）等單因素條件的改變對亞鐵氧化的影響，結(jié)果顯示未優(yōu)化之前固定化細胞的亞鐵氧化率在51%~60%之間。在得到的單因素實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，選出對亞鐵氧化率影響最顯著的三個因素，采用響應(yīng)面Design-Expert v8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面模型，考察不同固定因素如交聯(lián)時間、交聯(lián)轉(zhuǎn)速、鈣離子濃度三個因素對亞鐵氧化率的影響，優(yōu)化出混合腐蝕菌的最佳固定化條件，以便改善生物刻蝕加工微小構(gòu)件的質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

試驗菌種為氧化亞鐵硫桿菌（A.ferrooxidans ATCC 23270）和氧化硫硫桿菌（A.thiooxidans ATCC 19377）組成的混合腐蝕菌系。

1.1.2 儀器

電子天平（BT223S型，上海越平科學儀器有限公司）；pH計（PHB-4型，上海儀電科學儀器股份有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781L型，松下健康醫(yī)療器械株式會社）；空氣浴搖床（HZQ-C型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；高速冷凍離心機（2K15型，德國Sigma）；掃描電子顯微鏡（JSM-7500F型，日本電子株式會社）。

1.1.3 試劑

聚乙烯醇（聚合度1 750+50）、FeSO4·7H2O、（NH4）2SO4購自遼寧泉瑞試劑有限公司；海藻酸鈉、MgSO4·7H2O、Ca（NO3）2購自天津市大茂化學試劑廠；K2HPO4、K2Cr2O7采購自天津市永大化學試劑有限公司；KCl為天津市百世化工有限公司；Na2S2O3·5H2O購自天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；二苯胺磺酸鈉購自天津市科密歐化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

0K培養(yǎng)基：3 g（NH4）2SO4，0.5 g K2HPO4，0.5 g Mg－SO4·7H2O，0.1 g KCl，0.01 g Ca（NO3）2，蒸餾水1 L，用硫酸調(diào)節(jié)至所需pH[18]。

雙底物培養(yǎng)基：0K培養(yǎng)基中加入FeSO4·7H2O和Na2S2O3·5H2O，濃度分別達44.3 g·L-1和5 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)及收集

將混合腐蝕菌系以10%的接種量接種到雙底物液體培養(yǎng)基中，30℃，100 rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)菌體生長至對數(shù)期，取濾液用直徑50 mm 0.22 μm微孔濾膜過濾，棄掉濾液，將濾紙上的菌體用pH為2的H2SO4沖洗，菌體懸浮液2 000 rpm，5 min離心，收集上清液，棄去底部的鐵礬沉淀物。將上清液在12 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，用pH為2的H2SO4溶液懸浮沉淀，在12 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清，用pH為2的H2SO4溶液懸浮沉淀，重復(fù)離心至菌體中的鐵礬沉淀物完全去除，最后用pH為2的H2SO4溶液重新懸浮，制成菌懸液備用[19]。

1.2.2 混合菌系的細胞固定化

按質(zhì)量比10∶1的比例，稱取聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA），混合后倒入適量蒸餾水中，PVA和SA含量為9.0%（W/V）和0.9%（W/V），95℃水浴加熱2 h。使之完全溶解，密封后高壓蒸汽滅菌。在常溫條件下靜止存放約24 h，加入已備好的混合菌系菌懸液，輕緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，使之混合均勻。將此混合液倒入100格冷凍盒中，每個小格體積為1 cm3，存放于-20℃溫度下12 h，取出放入4℃環(huán)境下解凍，去除多余水分，制成1 cm3的小塊。按指定濃度Ca（NO3）2溶液、交聯(lián)時間、交聯(lián)轉(zhuǎn)速交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)束后保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞固定化條件的優(yōu)化

利用Design expert.V8.0.6軟件中Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面模型，考察交聯(lián)時間、交聯(lián)轉(zhuǎn)速、鈣離子濃度三個因素，進行細胞固定化條件的優(yōu)化，分別記為變量X1、X2、X3，每個因素取三個水平，以亞鐵氧化率為響應(yīng)值，記為Y。設(shè)計實驗方案，響應(yīng)面試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

將按照實驗設(shè)計條件制作好的固定化細胞微塊，放入裝有50 mL雙底物培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃，120 rpm搖床中培養(yǎng)72 h取樣，取樣1 mL。

1.2.4 分析方法

用重鉻酸鉀滴定法測定培養(yǎng)基中亞鐵離子的濃度[20]。取200 μl樣品，加入1 mL比例為1∶1的硫磷混酸，加入2滴0.2%二苯胺磺酸鈉，用0.005 mol·L-1的重鉻酸鉀標準溶液滴定，由無色變?yōu)樽仙珵榈味ńK點，計算亞鐵離子的氧化率。

1.2.5 固定化細胞掃描電鏡樣品制備方法

取固定化顆粒斷面，放入2.5%戊二醛中固定過夜。然后0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）中用超聲波清洗器振蕩半分鐘后，反復(fù)沖洗3次，每次15 min。再放入1%鋨酸中暗處固定1 h。用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）沖洗3次，每次15 min。用70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水，每次6 min，加入包埋劑固化置于烘箱中40℃和70℃各24 h，離子鍍膜。采用JSM-7500F型掃描電鏡（成像電壓為5 kV，放大倍數(shù)10 000倍，工作距離為5.8 mm）表征固定化細胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，分析微生物的生長環(huán)境，以及交聯(lián)過程的包埋塊結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化細胞微塊制備

通過實驗制作得到外形規(guī)范的固定化細胞微塊，交聯(lián)后機械強度、彈性較好，無粘連情況，能夠在酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h穩(wěn)定存在。生長24 h后固定化細胞微塊由乳白色變?yōu)辄S色，培養(yǎng)基呈微微黃褐色，說明氧化亞鐵硫桿菌在固定化細胞微塊中生長情況較好。

2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.2.1 模型方程的建立及方差分析

通過實驗得到各種固定化條件下的亞鐵氧化率，結(jié)果見表2。利用Design expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到回歸方程為Y=76.16+3.05 A-0.80 B+2.00 C-2.75 AB+3.75 AC-2.30 BC-15.73 A2-10.53 B2-13.88 C2，表3顯示了每個回歸系數(shù)的顯著性結(jié)果。結(jié)果顯示此回歸模型極其顯著（P<0.000 1）。其中A、A2、B2、C2對Y值的影響極顯著（P<0.000 1）。其他因素如C、AB、AC、BC也對Y值影響顯著（P<0.05）。各因素對亞鐵氧化率的影響因素大小是A>C>B，即鈣離子濃度影響力最大，其次是交聯(lián)轉(zhuǎn)速，交聯(lián)時間影響力最小。交互項AC、AB、BC顯著，表明鈣離子濃度與交聯(lián)時間、鈣離子濃度與交聯(lián)轉(zhuǎn)速、交聯(lián)轉(zhuǎn)速與交聯(lián)時間都存在顯著交互作用。方差分析結(jié)果顯示模型的F值為266.05，說明模型是有效的。R2=99.71，R2adj=99.33表示模型的擬合度較好，CV值<10%，說明實驗的可信度和精確度較好。Adeq Precision值大于4是可取的，說明實驗?zāi)Ｐ涂捎糜趯嶒炘O(shè)計，各影響因素對亞鐵氧化率的影響為非線性關(guān)系，適用于氧化亞鐵硫桿菌固定化細胞對亞鐵氧化率的預(yù)測。

圖1 不同培養(yǎng)時間固定化細胞微塊生長情況（a，培養(yǎng)時間0 h；b，培養(yǎng)時間24 h）Fig.1 Growth of immobilized cells under different culture time（a，culture time 0 h；b，culture time 24 h）

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface analysis experimental design and response values

表3 亞鐵氧化率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis table of ferrous oxidation regression model

續(xù)表3亞鐵氧化率回歸模型方差分析Continue table 3 Variance analysis table of ferrous oxidation regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析

通過多元回歸分析，得到圖2三組響應(yīng)面圖形與等高線圖。其中a、b分別代表交聯(lián)轉(zhuǎn)速不變下，交聯(lián)時間和鈣離子濃度的響應(yīng)面圖形和等高線圖；c、d分別代表交聯(lián)時間不變下，交聯(lián)轉(zhuǎn)速和鈣離子濃度的響應(yīng)面圖形和等高線圖；e、f分別代表鈣離子濃度不變下，交聯(lián)時間和交聯(lián)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面圖形和等高線圖。等高線趨于橢圓形，表明兩兩之間相互作用顯著，等高線趨于圓形則表明相互作用不顯著。由響應(yīng)面圖a、c、e中可以看出，單方面增加鈣離子濃度、交聯(lián)時間和交聯(lián)轉(zhuǎn)速，亞鐵氧化率都是先增加后減少。由等高線圖b、d、f可以看出，三個因素兩兩之間相互作用顯著。交聯(lián)轉(zhuǎn)速極大值出現(xiàn)在112~128 rpm，交聯(lián)時間極大值出現(xiàn)在57~63 min；鈣離子濃度極大值出現(xiàn)在2.5%~3.5%。通過分析得到細胞固定化最佳條件為鈣離子濃度3%、攪拌轉(zhuǎn)速120 rpm、交聯(lián)時間為60 min，得到最大亞鐵氧化率為77.3%。

圖2 交聯(lián)時間、鈣離子濃度、交聯(lián)轉(zhuǎn)速對亞鐵氧化率影響的三維圖（a，c，e）和等高線圖（b，d，f）Fig.2 Three-dimensional map（a，c，e）and contour map（b，d，f）of the effects of cross-linking time，the concentration of calcium ion，and cross-linking speed on the oxidation rate of ferrous iron

模型的充分性檢查，確保它提供了響應(yīng)和因子之間關(guān)系的最大近似，最小二乘法的殘差是判斷模型充分性的重要工具，由圖3顯示了殘差和預(yù)測響應(yīng)值，模型殘余塊是隨機分布的，沒有任何趨勢。結(jié)果表明，隨著二次模型的不斷變化和充分性，對最大響應(yīng)的預(yù)測是正確的。

圖3 模型預(yù)測值與殘差的殘差圖Fig.3 Residual plot of predicted value and residual

2.3 固定化細胞的SEM表征

固定化細胞的高效率和穩(wěn)定性與其微觀結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。圖4分別為接菌種和未接菌種固定化細胞微塊在交聯(lián)0、25、75 min掃描電鏡圖片。圖中可看出未接菌的固定化細胞微塊表面光滑，接菌的固定化細胞小塊存在小坑并形成了大小孔隙結(jié)構(gòu)，隨著交聯(lián)時間的增加，孔隙生成的越多，生成的孔隙結(jié)構(gòu)越好，該結(jié)構(gòu)有利于混合菌系的代謝及其營養(yǎng)物質(zhì)的運輸擴散。

圖4 培養(yǎng)前固定化細胞微塊電鏡表征圖（a，c，e代表未接菌種固定化細胞微塊交聯(lián)0、25、75 min；b，d，f代表混合菌系固定化細胞微塊交聯(lián)0、25、75 min）Fig.4 Scanning electron microscope of immobilized cells before culture（a，c，e，cross-linking of immobilized cells of uninoculated bacteria at 0，25，75 min；b，d，f，cross-linking of immobilized cells of mixed corrosion bacteria at 0，25，75 min）

固定化細胞微塊置于雙底物培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后進行SEM表征，圖5為活化后SEM表征圖。結(jié)果顯示，經(jīng)培養(yǎng)活化后，固定化載體的微觀空洞結(jié)構(gòu)進一步改善，空隙更多，形成許多立體三維小孔，這些小孔為混合菌系的定殖、生長、代謝提供了良好的環(huán)境。這些空隙結(jié)構(gòu)既被載體隔離，同時又通過溝壑結(jié)果進行連接，非常利于營養(yǎng)物質(zhì)、氧、熱的傳送和運輸。

圖5 活化培養(yǎng)后固定化細胞微塊電鏡表征圖Fig.5 Scanning electron microscope of immobilized cells after activated culture

2.4 驗證實驗

為確定模型所得結(jié)果的準確性，在模型最優(yōu)細胞固定化條件下進行三次重復(fù)實驗，亞鐵氧化率分別為76.45%、76.52%、76.42%，得到平均亞鐵氧化率為76.43%±0.09%，統(tǒng)計學分析表明與預(yù)測亞鐵氧化率76.45%無顯著差異（P>0.05），表明實驗?zāi)Ｐ途_度較高。

3 討論

氧化亞鐵硫桿菌具有將亞鐵離子氧化成為鐵離子的功能，由于擁有這等性質(zhì)，氧化亞鐵硫桿菌在生物脫硫、生物浸礦和處理電子垃圾方面廣泛應(yīng)用[18]。聚乙烯醇具有很多優(yōu)點，機械強度好，傳質(zhì)性能好，耐生物分解性也好，固定也比較容易，而且成本較低。對細胞無毒、價廉易得，是目前國內(nèi)外研究最為廣泛的一種包埋固定化載體材料，且能夠在酸性條件下存在。PVA-SA體系在生物細胞固定化有較好的機械強度，能保持較好的生物活性，是一種較為理想的細胞固定化材料[21]。PVA分子含有較多羥基，這些羥基隨著時間的變化會自己凝聚在一起。因此在PVA-SA溶解后放置24 h以提高微塊的性能。細胞固定化的條件對亞鐵氧化率有多方面的影響，其中PVA濃度、SA濃度、鈣離子濃度，交聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速為主要調(diào)控因素，已有研究表明氧化亞鐵硫桿菌在9%PVA的濃度時固定化具有較好的生物活性[16]。過高的SA濃度會導(dǎo)致PVA、SA混合不充分，溶液粘度值增大。SA濃度過低則包埋微塊不易成型[22]。實驗在前期研究基礎(chǔ)上選用PVA和SA含量分別為9.0%（W/V）和0.9%（W/V），采用響應(yīng)面分析法以亞鐵氧化率為響應(yīng)值，考察鈣離子濃度、交聯(lián)轉(zhuǎn)速和交聯(lián)時間三個因素對氧化亞鐵硫桿菌細胞功能的影響。結(jié)果表明，隨著鈣離子濃度、交聯(lián)時間的增加，亞鐵離子的氧化率是先增加后降低，說明適量增加鈣離子和增加交聯(lián)時間能更有利于菌體的生長，生成更適合混合菌系的生長環(huán)境。但鈣離子濃度過高、交聯(lián)時間過長，會導(dǎo)致生成的包埋體系吸收過多的鈣離子，生成過量的海藻酸鈣，增加鈣離子在培養(yǎng)基中的脫落時間。不利于盡快生成較好的孔隙結(jié)構(gòu)，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，影響菌體的生長。實驗最終得到鈣離子濃度為3%；交聯(lián)時間60 min；交聯(lián)轉(zhuǎn)速120 rpm的最佳細胞固定化條件。雖然研究對鐵硫腐蝕菌的固定化條件進行了優(yōu)化，得到了最佳的優(yōu)化條件，固定化效率是否能真正達到理想化，是否適合經(jīng)濟適用還有待探究。

SEM分析顯示隨著交聯(lián)時間的增加，固定化細胞微塊孔隙結(jié)構(gòu)越好，活化后生成較好的孔隙結(jié)構(gòu)，是因為海藻酸鈉在交聯(lián)時與硝酸鈣反應(yīng)生成海藻酸鈣凝膠，冷凍的過程中通過PVA分子間的自凝聚作用形成PVA凝膠[23]。雙底物培養(yǎng)基的pH值為2，在酸性環(huán)境下海藻酸鈣凝膠溶解，PVA凝膠因具有耐酸性而留下來，所以活化后固定化細胞微塊有更好的微觀孔隙結(jié)構(gòu)，有較好的通透性，有利于菌體的生長。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面實驗得到腐蝕混合菌系的最佳細胞固定化條件為鈣離子濃度3%、交聯(lián)轉(zhuǎn)速120 rpm、交聯(lián)時間為60 min，得到最大亞鐵氧化率為77.3%。SEM表征得到固定化細胞小塊在活化后生成較好的孔隙交錯的結(jié)構(gòu)，形成許多三維立體小孔，有利于菌體的生長繁殖。