楊健，王偉東，王彥杰，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

鐵氧化菌大多是革蘭氏陰性細菌，是一類以CO2作為碳源、嗜酸并且化能自養(yǎng)、推動鐵循環(huán)的微生物[1-2]，能夠通過將Fe2+氧化成Fe3+獲得能量，其產(chǎn)能方程式為：2Fe2++1/2O2+2H+→2 Fe3++H2O+88.7KJ[3]。鐵氧化菌廣泛分布于礦區(qū)廢水、工業(yè)廢水、湖泊、溫泉、熱泉、火山堰塞湖等水環(huán)境中，在生物圈中無處不在。經(jīng)過研究學(xué)者分離純化，種類繁多鐵氧化菌被分離出來并獲得純培養(yǎng)菌株，其中較為常見的有銹鐵菌屬、纖毛鐵細菌屬、嗜酸性氧化亞鐵桿菌屬等[4]。鐵氧化菌作為重要的生物浸礦菌種，被廣泛應(yīng)用于銅，鎳，金，鈾等金屬的工業(yè)化生物浸出過程中[5-7]。在生物浸出過程中，鐵氧化菌的生物浸出能力通常會因環(huán)境條件的變化而受到影響。比如溫度的升高，pH的變化，營養(yǎng)物質(zhì)的減少及重金屬離子的出現(xiàn)和濃度升高等，這些浸出條件的變化不利于鐵氧化菌正常發(fā)揮其浸出功能，因此會極大降低鐵氧化菌的浸出活性和金屬回收率[8]。盡管研究表明，鐵氧化菌經(jīng)過長期的生物浸出金屬礦石應(yīng)用后，鐵氧化菌對很多重金屬離子耐受能力逐漸提升，更加適合生物浸出金屬礦石中的金屬，具有極高的金屬浸出率[9-10]。但將鐵氧化菌用于生物浸出回收電路板中的金屬時，其應(yīng)用難度將增加。電路板與金屬礦石組成大不相同，電路板中主要有銅、鎳、鉻、鎘、鉛、金、銀等金屬，并且它們在電路板中的含量普遍高于在礦石中的含量[11]，與生物浸出回收金屬礦石中的金屬相比，生物浸出回收電路板中的金屬更加依賴鐵氧化菌對多種重金屬的金屬耐受性。銅離子和鎳離子是電路板中含量較多的金屬，也是生物浸出電路板時最容易回收、最常出現(xiàn)的金屬[12]。當(dāng)銅和鎳離子含量相對于其他金屬離子含量較低時，對于鐵氧化菌的生物浸出能力的影響是極小的，對鐵氧化菌的生長是低害或無害的，鐵氧化菌仍然會保持較高的亞鐵氧化活性和生物浸出能力，但是隨著生物浸出進程的推進，浸出液中內(nèi)銅鎳離子的含量不斷增加，就會逐漸表現(xiàn)出對鐵氧化菌細胞的毒害作用，鐵氧化菌的亞鐵氧化活性逐漸被抑制，生物浸出能力降低，鐵氧化菌的生物學(xué)活性受到影響，最終導(dǎo)致金屬回收率的降低[13]。

為此，很多研究借用固定化的方式避免金屬對鐵氧化菌的毒害。研究表明利用鐵氧化菌固定化細胞浸出電路板中金屬是可行的，并且綠色環(huán)保，節(jié)約經(jīng)濟成本。作為一種常見的生物工程方法，固定化技術(shù)在廢水無害化處理、難降解物質(zhì)無害化處理、土壤改良等領(lǐng)域的應(yīng)用研究已取得了豐碩的成果[14]。固定化細胞有很多好處：首先固定化細胞容易制備，并且與菌種的活化和培養(yǎng)相比更加方便和實用；其次固定化細胞更加易于保存和使用，可以將固定化細胞保存在冰箱中，使用時固定化的菌種可以很快地在液體培養(yǎng)中恢復(fù)自由，能夠快速在培養(yǎng)液中生長繁殖。但目前固定化載體大多使用壽命有限，無法循環(huán)使用，而且價格較為昂貴。因此，一些廉價的固定化載體如紗布[15]、聚氨酯泡沫[16]、海藻酸鈉[17]小球逐漸被開發(fā)應(yīng)用于固定化的過程中。但因固定化載體的限制仍存在對固定量少、固定時效短、固定效果差等問題。

基于上述問題，研究選用疏松多孔的火山石作為固定化材料，火山石相比其他固定化材料更廉價，組成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，更容易獲得，依托黑龍江省五大連池火山群落天然地理優(yōu)勢，使得火山石發(fā)揮其獨特價值，具有極高的應(yīng)用價值[18]。在此基礎(chǔ)上選取高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2—25，在前期試驗中證實該菌株在10～30 mmol·L-1銅、鎳、鉻、鎘離子培養(yǎng)液中，均保持60%以上的Fe2+氧化率，因此選用該菌株作為火山石固定化菌株。同時在前期單因素研究基礎(chǔ)上，確定了影響火山石固定化鐵氧化菌效果顯著因素是火山石粒徑、固定化時間和搖床轉(zhuǎn)速。因此通過響應(yīng)面試驗設(shè)計，以火山石粒徑、固定化時間和搖床轉(zhuǎn)速為響應(yīng)變量，以Fe2+氧化率為響應(yīng)值，最終確定火山石固定化鐵氧化菌的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，采用SEM表征火山石對鐵氧化菌的固定化能力。從而得到一種火山石固定高金屬耐受鐵氧化菌的固定化顆粒，為生物浸出及固定化領(lǐng)域開發(fā)廉價可行的固定化材料和設(shè)計方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗中所用高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2—25菌株由黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化重點實驗室鐵氧化菌菌種資源庫提供。

1.1.2 試劑

硫酸銨；三水磷酸氫二鉀；七水硫酸鎂；氯化鉀；硝酸鈣；七水硫酸亞鐵；98%硫酸；98%磷酸；二苯胺磺酸鈉；重鉻酸鉀。

1.1.3 儀器

恒溫振蕩器（HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、磁力攪拌器（JB-5，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、pH計（PHB-4，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781LPC，松下健康醫(yī)療器械株式會社），掃描電子顯微鏡（S4800，株式會社日立制作所）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基方案

研究所使用的培養(yǎng)基配方為改良的9K培養(yǎng)基[19]，其組成為：（NH4）2SO43 g·L-1，KCl 0.1 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4x 7H2O 0.5 g·L-1，Ca（NO3）20.01 g·L-1，室溫條件下使用5 MH2SO4調(diào)節(jié)pH至2.0，高壓蒸汽滅菌后，使用0.22 μm濾膜過濾加入40 g·L-1的Fe－SO4x 7H2O。

1.2.2 火山石對高金屬耐受性鐵氧化菌固定化條件的優(yōu)化

在前期研究中，以Fe2+氧化率為目標(biāo)，通過單因素實驗探究了溫度（20、25、30、35、40℃）、火山石粒徑（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm）、固定化時間（12、24、36、48、60 h）、搖床轉(zhuǎn)速（40、60、80、100、120 rpm）對于固定化效果的影響。結(jié)果表明，火山石粒徑、固定化時間、搖床轉(zhuǎn)速對于固定化效果影響最為顯著。因此在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Design-Expert 12.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面模型，考察固定化條件對Fe2+氧化率的影響，其中響應(yīng)變量設(shè)定為火山石粒徑（X1）、固定化時間（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3），以Fe2+氧化率（Y）為響應(yīng)值，從而獲得最佳固定化條件。表1是響應(yīng)面試驗因素水平表。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

固定化所采用的火山石采集自五大連池火山群落。固定化試驗前，將需要使用的火山石用25%硫酸浸泡12 h，然后使用清水沖洗火山石至無雜質(zhì)，挑選50 g形態(tài)較完整的火山石滅菌后備用。

配制90 mL改良的9K培養(yǎng)基放入250 mL錐形瓶內(nèi)，將火山石放入改良的9K培養(yǎng)基中，按照10%（v/v）接種培養(yǎng)至對數(shù)期的鐵氧化菌菌液，置于恒溫振蕩器培養(yǎng)，每組試驗以不接菌的做空白對照，固定化試驗完成后。將鐵氧化菌火山石固定化顆粒更換新的培養(yǎng)液培養(yǎng)100 h后，測定培養(yǎng)液中亞鐵氧化情況。每組實驗結(jié)果跟空白作比較。Fe2+濃度的測定采用重鉻酸鉀滴定法[20]。

1.2.3 氧化亞鐵硫桿菌的固定化表征

火山石固定化效果采用SEM進行表征，SEM（S-4800，HITACHI，日本）的工作電壓為2.0 kV，放大倍數(shù)為8.99 mm×10.0 K，采用壓片法對火山石的固定化能力進行表征。方法如下：取樣品置于粘有導(dǎo)電膠的樣品臺上，按壓緊實，自然風(fēng)干；左低右高進入機器；設(shè)備進行抽真空操作，待抽真空完成后，開啟電鏡觀察；在不同的倍數(shù)下尋找需要觀察的目標(biāo)，調(diào)節(jié)視野；找到目標(biāo)后，聚焦，拍照，對需要能譜分析的目標(biāo)進行分析；完成后，將圖譜輸出。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS（Version 20，IBM SPSS，Statistics 20.0）進行數(shù)據(jù)處理，利用Origin Pro（Version 2019b.Originlab Corporation，Northampton，MA.USA）進行繪圖，通過Design Expert 12.0（Version 12.0.3.0，1300 Godward Street Northeast，Suit 6400 Minneapolis，MN 55413）進行響應(yīng)面實驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 火山石對高金屬耐受性鐵氧化菌固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面實驗

采用Box-Benhnker模型對固定化條件進行優(yōu)化，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

續(xù)表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Continued table 2 Box-Behnken experimental design and response values

2.1.2 模型方程的建立及方差分析

通過Design Expert 12.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得回歸方程：Y=Ln[（ferrous oxidation rate-1.00）/（100.00-ferrous oxidation rate）]。其方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

回歸方差分析顯著性表明，此回歸模型顯著（P<0.05），C、AC、A2、C2對Y值影響也很顯著（P<0.05）。各因素對Fe2+氧化率的影響順序依次是B>A>C，即固定化時間對Fe2+氧化率的影響最大，其次是火山石粒徑，最后是搖床轉(zhuǎn)速。交互項AB相對其他交互項相對顯著，表明火山石粒徑與固定化時間存在顯著交互作用，各影響因素對Fe2+氧化率的影響為非線性關(guān)系。根據(jù)圖1可看出，模型的預(yù)測值與實際值十分接近，線性擬合相關(guān)系數(shù)R2達到95.91，R2ADJ為90.66。結(jié)果表明，該模型與實際實驗擬合較好。

圖1 Fe2+氧化率理論值與實際值分布圖Fig.1 Distribution diagram of theoretical value and actual value of ferrous oxidation rate

2.1.3 Fe2+氧化率的單因子響應(yīng)分析

如圖2所示火山石粒徑A，固定化時間B、搖床轉(zhuǎn)速C，3個因子對Fe2+氧化率影響曲線的合成圖，將其它2個因子固定在中等水平時，每個獨立因子對響應(yīng)變化的影響。以Fe2+氧化率為縱坐標(biāo)，三因子的取值范圍為橫坐標(biāo)，并采用編碼替代三因素的實際值：-1～0～1代表火山石粒徑0.5～1.0～1.5 cm或固定化時間30～42～54 h，或者搖床轉(zhuǎn)速40～80～120 rpm，三個自變量因子的中間值即1.0，42和80。為研究其中任單一因變化時的固定取值，如研究火山石粒徑對Fe2+氧化率的影響時，固定化時間和搖床轉(zhuǎn)速分別固定為42 h和80 rpm。圖2中各單因子的擾動對響應(yīng)值變化趨勢可看出，A和B兩個因子在區(qū)間[-1，1]內(nèi)Y值的變化是先增大后減小，A因子在1.000水平附近達到最大值；B因子在1.000水平附近達到最大值；C因子在[-1，1]內(nèi)Y值變化逐漸升高，在1.000水平附近達到最大值。

圖2 火山石粒徑（A）、固定化時間（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）的單因子曲線圖Fig.2 Single factor curves of particle size（a），immobilization time（b）and ratation speed（c）of volcanic rocks

2.1.4 響應(yīng)面分析

利用Design Expert 12.0軟件繪出兩兩自變量為坐標(biāo)的等高線圖，從圖3中可以看出，火山石粒徑與搖床轉(zhuǎn)速的響應(yīng)曲面近似橢圓形，證明火山石粒徑與搖床轉(zhuǎn)速對Fe2+氧化率的交互作用相對于其他因素相對較強，而火山石粒徑與固定化時間以及搖床轉(zhuǎn)速和固定化時間的等高線圖則顯示其交互作用并不明顯。通過響應(yīng)面實驗，確定火山石固定化鐵氧化菌YFS2—25的最佳條件為：火山石粒徑1.5 cm，固定化時間42 h，搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm。通過驗證實驗，所得結(jié)果與模型結(jié)果非常接近，證實所得模型是可行的。

圖3 火山石粒徑、固定化時間、搖床轉(zhuǎn)速對Fe2+氧化率影響的等高線圖（a～c）Fig.3 Contour map（a～c）of effects of particle size，immobilization time and rotation speed of shaking size on ferrous oxidation rate

2.1.5驗證試驗

為進一步驗證該模型的準(zhǔn)確性和有效性，根據(jù)最優(yōu)條件進行3次重復(fù)實驗，結(jié)果得到的Fe2+氧化率分別為97.02、96.62和96.52，平均Fe2+氧化率為96.72±0.14，與預(yù)測的Fe2+氧化率96.58無顯著差異，表明該模型較準(zhǔn)確。

2.2 SEM表征高金屬耐受性鐵氧化菌的火山石固定化

基于響應(yīng)面試驗的最優(yōu)固定化條件，以鐵氧化菌YFS2-25為固定化菌株，火山石為固定化載體進行高金屬耐受性鐵氧化菌的火山石固定化試驗。試驗結(jié)果如圖4所示，由圖4a、e可以觀察到未固定的火山石表面有孔隙，固定之后，細菌附著在火山石表面，細菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等在火山石表面形成生物膜，火山石表面變得光滑；從圖4b、f中可以看出大量的鐵氧化菌附著在火山石的表面，并且數(shù)量極多；隨著顯微鏡放大倍數(shù)的增加，從圖4c、g可見越來越多的鐵氧化菌吸附在火山石表面，火山石的孔洞、裂隙中也存在著大量的鐵氧化菌；從圖4e、h中可以觀察到固定化鐵氧化菌后，火山石表面由原來的覆蓋有密集的球狀突起變?yōu)楦采w著一層致密的鐵氧化菌，鐵氧化菌包裹著這些密集的球狀凸起，并且連接成片，形成一個內(nèi)陷的小孔。由此可見，火山石作為高耐受性鐵氧化菌的固定化載體是可行的。

圖4 掃描電鏡下的火山石表面（a，b，c，d：固定化前；e，f，g，h：固定化后）Fig.4 Surface of volcanic rocks under SEM（a，b，c，d：before immobilization；e，f，g，h：after immobilization）

3 討論

目前由于鐵氧化菌能夠?qū)嗚F離子氧化成三價鐵離子的特性，將鐵氧化菌廣泛應(yīng)用于生物浸出中，結(jié)合多種固定化載體，使其更加適用于生物浸出當(dāng)中，使鐵氧化菌在尾礦治理、生物冶金等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價值[21]。但是，固定化載體的材料大多存在造價昂貴，攜帶菌體量少，材料毒性大，不適于鐵氧化菌生長等問題。導(dǎo)致載體成為了鐵氧化菌固定化細胞應(yīng)用于生物浸出的關(guān)鍵因素。研究主要以實驗室現(xiàn)有的高金屬耐受性鐵氧化菌YFS2-25為固定化菌株出發(fā)，采用響應(yīng)面分析法對火山石固定化高金屬耐受性鐵氧化菌的條件進行優(yōu)化，選擇Box-Behnken設(shè)計以火山石粒徑、固定化時間和搖床轉(zhuǎn)速為響應(yīng)因素，以Fe2+氧化率為響應(yīng)值，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，火山石粒徑1.5 cm、固定化時間42 h和搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm。同時通過驗證實驗，證明在該條件下，可以得到最高的Fe2+氧化率。

以SEM表征火山石固定化鐵氧化菌的能力，正如結(jié)果所示，火山石在與鐵氧化菌共培養(yǎng)后，在SEM下觀察到火山石表明有明顯的菌落痕跡。在SEM下，火山石表面出現(xiàn)鐵氧化菌的堆積，又因為火山石的疏松多孔結(jié)構(gòu)，因此火山石相比其他固定式載體，可固定攜帶更多對的微生物細胞。細胞固定化后，利用培養(yǎng)液對固定化細胞進行培養(yǎng)，雖然生長比較緩慢，但在試驗周期內(nèi)，一直處于不斷的生長階段，表明固定化細胞具有較長的生長周期，這對于構(gòu)建生物反應(yīng)器，從中獲取有價值的活性物質(zhì)是十分有利的。

迄今為止，大多數(shù)固定化細胞技術(shù)應(yīng)用還處于實驗室研究水平，工業(yè)化的投入發(fā)展離不開高效固定化生物反應(yīng)器的研制，同時部分常用的固定化細胞載體對細胞酶活存在著一定的毒性，聚丙烯酰胺、明膠等常用固定化材料也依然存在價格較高的問題。因此，開發(fā)新型高效、無毒、廉價的固定化材料仍是目前固定化細胞技術(shù)發(fā)展的主要方向。相信在材料學(xué)及生物學(xué)高速發(fā)展的當(dāng)今，固定化技術(shù)能夠得到不斷創(chuàng)新，并應(yīng)用于更多大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護領(lǐng)域。

4 結(jié)論

以高金屬耐受性鐵氧化菌為固定化菌株，以Fe2+氧化率為衡量指標(biāo)，通過利用火山石做為固定化載體對鐵氧化菌進行固定化，用響應(yīng)面軟件對其進行發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出最優(yōu)固定化條件：在最佳固定化條件山石粒徑1.5 cm、固定化時間42 h和搖床轉(zhuǎn)速為120 rpm下，可以得到最高的Fe2+氧化率。在此基礎(chǔ)上，以火山石作為固定化載體固定化高金屬耐受性的鐵氧化菌取得了極好的固定化效果，火山石作為固定化載體將成為生物浸出的極大助力，不僅可以降低成本，同時組成穩(wěn)定，攜帶鐵氧化菌數(shù)量多，相比常見的固定化載體，火山石做為固定化載體的實用性更強，固定化能力更好。