牛春艷，張永卓，楊佳怡，董蓮華，傅博強(qiáng)，王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029)

1 引 言

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性被證實(shí)適用于測(cè)量中或標(biāo)稱特性檢查中的預(yù)期用途。有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)則是附有權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的文件，提供使用有效程序獲得的具有不確定度和溯源性的一個(gè)或多個(gè)特性量值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[1]。有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是量值溯源和傳遞過程中的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，用于儀器設(shè)備校準(zhǔn)、檢測(cè)方法評(píng)價(jià)、產(chǎn)品質(zhì)量控制等方面。

豬繁殖與綜合癥是一種對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的高度傳染性疾病。豬繁殖與綜合癥病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的核酸檢測(cè)技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于豬繁殖與綜合癥的診斷和預(yù)防控制、流行病學(xué)研究等過程中[2～5]。研制豬繁殖與綜合癥病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將為不同檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)、不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果比對(duì)提供標(biāo)尺。

數(shù)字PCR方法是一種不依賴于外標(biāo)對(duì)核酸分子進(jìn)行核酸定量的技術(shù)，通過直接計(jì)數(shù)再根據(jù)泊松分布計(jì)算樣本原始核酸拷貝數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸絕對(duì)定量[6～8]。按照獨(dú)立單元的實(shí)現(xiàn)方式，數(shù)字PCR可分為基于芯片式微流控的微陣列芯片式數(shù)字PCR和基于液滴微流控的微滴數(shù)字PCR[9]。

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是含有外源基因的線性或環(huán)狀質(zhì)粒分子，易于保存與運(yùn)輸，使用方便。中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院研制了多種轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)用質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[10]，并對(duì)質(zhì)粒DNA與基因組DNA的可替代性做了比較研究，驗(yàn)證了質(zhì)粒分子的適用性。本研究針對(duì)制備的豬繁殖與綜合癥病毒質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，建立數(shù)字PCR定量方法，聯(lián)合多家實(shí)驗(yàn)室利用數(shù)字PCR方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行合作定值研究，并評(píng)定了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度，獲得了豬繁殖與綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)及美洲變異株(PRRSV HuN4)兩種質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器及試劑

微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)(QX200，美國(guó)伯樂公司)；普通PCR儀(Veriti，美國(guó)Applied Biosystems公司)；芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-Mark，美國(guó)富魯達(dá)公司)。

Tagman基因表達(dá)預(yù)混液(美國(guó)Applied Biosystems公司)；37k集成微流體芯片(Sample loading reagent，美國(guó)富魯達(dá)公司)；微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)液(SuperMix for Probes，美國(guó)伯樂公司)：微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油。

實(shí)驗(yàn)中豬繁殖與呼吸綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒株美洲變異株(PRRSV HuN4)為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物制備

選擇PRRSV HuN4及CH-1a兩種毒株，將基因組cDNA中包含M基因及N基因的一段保守序列克隆至質(zhì)粒中，經(jīng)過EcoRⅠ單酶切線性化，得到線性化質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，模擬病毒基因組cDNA?？寺∮脭U(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列為：

PRRSV-C-F：

(5′-CGGGATCCAAGGTGCTTTTGGCGTT-3′)

PRRSV-C-R：

(5′-AACTGCAGCGCATGGTTCTCGCCAAT-3′)。

2.3 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系為：SuperMix for Probes 10 μL，上、下游引物各0.8 μL(終濃度400 nmol/L)，探針0.8 μL(終濃度240 nmol/L)，cDNA模板4 μL，加ddH2O補(bǔ)足終體積至20 μL。實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火 1 min，40個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 min。

反應(yīng)引物及探針序列：

上游引物：5′-CTAGGCCGCAAGTACATTCT-3′

下游引物：5′-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3′

探針：

5′-FAM-ATTTGCCGCAATCGGATGAAAGCC-BHQ1-3′

引物及探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.4 芯片式數(shù)字PCR

芯片式數(shù)字PCR反應(yīng)體系為：Tagman基因表達(dá)預(yù)混液2 μL，Sample loading reagent 0.2 μL，上、下游引物各0.16 μL(終濃度200 nmol/L)，探針0.16 μL(終濃度400 nmol/L)，模板0.8 μL，加ddH2O補(bǔ)足終體積至4 μL。實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)引物及探針序列與微滴式數(shù)字PCR相同。

2.5 合作定值過程

選擇在核酸檢測(cè)領(lǐng)域具備較強(qiáng)能力的實(shí)驗(yàn)室，最終選擇8家實(shí)驗(yàn)室參加兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。將參加定值的實(shí)驗(yàn)室(包括組織單位)編號(hào)為A,B,C,D,E,F,G,H,I，其中CH-1a由8家單位(A,B,C,D,E,F,G,H)定值，HuN4由8家單位(A,B,C,D,E,F,G,I)定值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定4管樣品，每管樣品重復(fù)測(cè)量3次。

2.6 定值數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與處理。利用夏皮羅-威爾克法檢驗(yàn)定值數(shù)據(jù)的正態(tài)性，利用狄克遜法及格拉布斯法兩種方法分別檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的可疑值，利用科克倫法檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)是否等精度，用各組平均值表示定值結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 微滴式數(shù)字PCR方法

前期通過參數(shù)優(yōu)化建立了微滴式數(shù)字PCR方法[11]，首先對(duì)引物及探針濃度進(jìn)行了梯度設(shè)置，選擇的體系為引物濃度400 nmol/L，探針濃度240 nmol/L；其次對(duì)退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)陰性擴(kuò)增信號(hào)與陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)差異最大的原則，選擇54 ℃作為退火條件。利用建立的方法檢測(cè)質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。以線性化質(zhì)粒為模板，進(jìn)行梯度稀釋，檢驗(yàn)方法線性關(guān)系及重復(fù)性, 結(jié)果見圖1。圖1中X為稀釋系數(shù);Y為核酸拷貝數(shù)濃度,copy/μL?？梢钥闯鏊⒌奈⒌问綌?shù)字PCR方法檢測(cè)質(zhì)粒線性關(guān)系良好(R2為0.999 8)，最小相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.53%。

圖1 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)線性關(guān)系Fig.1 Linearity of ddPCR

3.2 芯片式數(shù)字PCR方法

優(yōu)化建立了芯片式數(shù)字PCR方法。由于37 k芯片反應(yīng)室個(gè)數(shù)為770，實(shí)驗(yàn)時(shí)需將陽(yáng)性反應(yīng)count個(gè)數(shù)控制在200～700，因此未進(jìn)行芯片式數(shù)字PCR反應(yīng)線性關(guān)系比較，而是以兩個(gè)不同濃度的線性化質(zhì)粒為模板(4倍稀釋)，檢驗(yàn)了方法的重復(fù)性。如表1所示。

表1 芯片式數(shù)字PCR方法的重復(fù)性Tab.1 Repeatability of cdPCR

在濃度水平1相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.09%，在濃度水平2相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.23%，表明在兩個(gè)濃度下，方法的重復(fù)性良好。對(duì)利用兩種不同濃度模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的原始樣品的定量結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明在兩個(gè)不同濃度下，方法的定量結(jié)果無(wú)顯著差異(p=0.49)。因此可選擇在此濃度范圍內(nèi)對(duì)模板進(jìn)行定量檢測(cè)。

3.3 兩種不同平臺(tái)定量結(jié)果比較

本研究利用兩種數(shù)字PCR平臺(tái)建立了微滴式數(shù)字PCR及芯片式數(shù)字PCR的方法，對(duì)方法的特異性、線性及重復(fù)性進(jìn)行了檢驗(yàn)，并進(jìn)一步對(duì)這兩種不同平臺(tái)對(duì)線性化質(zhì)粒模板的定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，驗(yàn)證了不同平臺(tái)數(shù)字PCR方法之間的一致性。

以HuN4，CH-1a兩種線性化質(zhì)粒為模板，分別利用微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)及芯片式數(shù)字PCR(cdPCR)兩個(gè)不同平臺(tái)的方法進(jìn)行定量，將定量結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，如圖2所示，結(jié)果表明兩種模板不同方法間p>0.05，表明無(wú)顯著差異，兩種方法定量結(jié)果一致性良好。

圖2 兩種不同平臺(tái)定量結(jié)果比較Fig.2 Comparison of two dPCR methods

3.4 合作定值結(jié)果

兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合作實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果見表2及表3。利用夏皮羅-威爾克法檢驗(yàn)定值數(shù)據(jù)的正態(tài)性，結(jié)果表明CH-1a及HuN4兩種樣品的8組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

表2 CH-1a實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Aanalysis of the results of collaborative labs for CH-1a 108 copy·μL-1

表3 HuN4實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Analysis of the results of collaborative labs for HuN4 108 copy·μL-1

用狄克遜法及格拉布斯法兩種方法分別檢驗(yàn)8家實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的可疑值。經(jīng)狄克遜檢驗(yàn)，查得f(0.05,8)=0.608。對(duì)于CH-1a，r1=0.168，rn=0.150；對(duì)于HuN4，r1=0.042，rn=0.325。r1值和rn值均小于f(α,n)，因此所有數(shù)據(jù)保留。經(jīng)格拉布斯法檢驗(yàn)，查得λ(0.05,8)=2.126。對(duì)于CH-1a，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=3.18×107；對(duì)于HuN4，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=2.98×107。經(jīng)計(jì)算，所有殘差均小于λ(0.05,8)·s，因此所有數(shù)據(jù)均保留。

用科克倫法檢驗(yàn)，m=8,n=4,α=0.01,查得臨界值C(0.01,8,4)=0.520 9,經(jīng)計(jì)算得CCH-1a=0.264 1，CHuN4=0.519 8，因此，CCH-1a

CH-1a及HuN4的測(cè)試結(jié)果均以8組數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值表示。

3.5 不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度uCRM來(lái)源由3個(gè)部分組成：第1部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合作定值引入的不確定度uchar；第2部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度ubb；第3部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度ustab。

其中合作定值引入的不確定度考慮了重復(fù)性引入的不確定度，反應(yīng)室體積引入的不確定度[12]以及稀釋過程引入的不確定度。

重復(fù)性引入的不確定度采用A類評(píng)定，按如下公式計(jì)算：

CH-1a重復(fù)性引入不確定度為：

uA=1.12×107copy/μL，urel(A)=0.012

HuN4重復(fù)性引入不確定度為：

uA=1.05×107copy/μL，urel(A)=0.014

單反應(yīng)室體積引入的不確定度采用文獻(xiàn)[12]的結(jié)果0.8%。

稀釋過程引入的不確定度包括移液器引入的不確定度以及溫度變化引入的不確定度。移液器引入的不確定度根據(jù)移液器校準(zhǔn)證書上給出的校準(zhǔn)點(diǎn)容量相對(duì)誤差計(jì)算，溫度變化引入的不確定度根據(jù)水的膨脹系數(shù)2.1×10-4℃-1，按均勻分布來(lái)計(jì)算。稀釋過程的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定CH-1a為0.020，HuN4為0.022。

定值過程的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度CH-1a為0.025，HuN4為0.027。

根據(jù)以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

在置信概率95%條件下，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U=kuCRM(k=2)。結(jié)果如表4所示。

表4 兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度Tab.4 Uncertainty of the two reference materials

3.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果表達(dá)

本研究得到的兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)果表達(dá)如下：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值為 9.40×108copy/μL，擴(kuò)展不確定度U(k=2)為 0.9×108copy/μL；豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲變異株(PRRSV HuN4)質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值為7.78×108copy/μL，擴(kuò)展不確定度U(k=2)為1.0×108copy/μL。

4 結(jié) 論

本研究選擇將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因組cDNA中保守序列克隆至質(zhì)粒中，經(jīng)過單酶切線性化，模擬病毒基因組cDNA，以數(shù)字PCR作為定值方法為其準(zhǔn)確定值，制備了線性化質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。優(yōu)化建立了質(zhì)粒核酸的數(shù)字PCR方法，并對(duì)微滴式數(shù)字PCR及芯片式PCR方法的檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行了檢驗(yàn)。多家實(shí)驗(yàn)室采用一種或多種準(zhǔn)確性確認(rèn)的方法進(jìn)行合作定值是保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確性的定值方式之一[13～15]。

利用建立的數(shù)字PCR方法組織8家實(shí)驗(yàn)室對(duì)制備的兩種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了合作定值。在合作定值過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度樣本在進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)時(shí)，需要將樣本提前進(jìn)行稀釋，而稀釋過程的控制對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性保證至關(guān)重要，包括移液器的計(jì)量校準(zhǔn)，稀釋用耗材的性能評(píng)價(jià)，稀釋的方法等方面。另外，由于生物樣本的特殊性，在經(jīng)過稀釋處理后的樣本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，防止樣品發(fā)生變化。

本項(xiàng)目研制的豬繁殖與綜合癥病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可直接用于方法建立、產(chǎn)品研發(fā)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，也可用于工作標(biāo)準(zhǔn)的賦值、方法評(píng)價(jià)、產(chǎn)品質(zhì)量控制等諸多方面。可為商品化病毒核酸檢測(cè)試劑盒中質(zhì)控品或校準(zhǔn)品提供質(zhì)量控制和量值溯源標(biāo)準(zhǔn)，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可比。