劉星，藺廣榮

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.濱州市人民醫(yī)院，山東 濱州 256610)

乳腺癌已經(jīng)成為全人類最常見(jiàn)的癌癥類型，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)的2020年全球癌癥情況分析，對(duì)女性來(lái)說(shuō)，乳腺癌是所有癌癥中發(fā)生頻率最高和致死的首要癌癥類型，每年呈遞增趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的身心健康[1]。乳腺癌作為一種異質(zhì)性高的疾病，根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2 extracellular domain，Her-2)和Ki-67表達(dá)情況分為不同的分子亞型，包括Luminal A、Luminal B、Her-2擴(kuò)增型和三陰型。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占總體乳腺癌發(fā)病率10%～20%，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，由于缺乏有效治療靶點(diǎn)，化療是主要的治療手段，近年來(lái)免疫治療、PARP抑制劑等的應(yīng)用一定程度上改善了部分三陰性乳腺癌的預(yù)后，但相較于其他亞型預(yù)后仍差，三陰型亟待尋求有效靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)新的有效的治療手段。隨著 RNA測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)逐漸進(jìn)入了人們的視野，它們不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，但參與了多種生物學(xué)進(jìn)程。越來(lái)越多的ncRNA在乳腺腫瘤發(fā)生的不同階段表現(xiàn)出巨大的潛力，影響細(xì)胞的死亡、代謝、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和耐藥性。在已知的ncRNA的研究中，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小 RNA(micro RNA，miRNA)被報(bào)道的比較多，lncRNA轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，在腫瘤中的作用不容小覷，包括在表觀遺傳調(diào)控、DNA損傷和細(xì)胞周期調(diào)控、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和介導(dǎo)激素導(dǎo)致的癌癥等。其中l(wèi)ncRNA BANCR是由BRAF基因發(fā)生突變后產(chǎn)生的，693-bp lncRNA，最早是Flockhart等人在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。繼而發(fā)現(xiàn)BANCR在甲狀腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、胃癌等多種腫瘤中均有異常表達(dá)，且與預(yù)后有一定相關(guān)性，然而其在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)TNBC癌灶及癌旁組織中BANCR表達(dá)水平差異，探討B(tài)NACR在TNBC中的表達(dá)意義及與患者術(shù)后的關(guān)系，為TNBC的治療及預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2015年12月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行乳腺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為TNBC的患者總計(jì)110例，均為女性，臨床病史資料完整，術(shù)前均未經(jīng)化療、內(nèi)分泌治療及其它任何抗腫瘤治療。年齡31～72歲，平均年齡(50.5±10.1)歲，<50歲42 例，≥50歲68 例；腫瘤直徑<5 cm 78 例，≥5 cm 32例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，無(wú)轉(zhuǎn)移 51例；未絕經(jīng) 62例，已絕經(jīng)48例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期67例，Ⅲ期43例。手術(shù)取材的新鮮冰凍組織標(biāo)本，置液氮冷卻后送-80 ℃冷凍冰箱保存。本研究經(jīng)過(guò)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有標(biāo)本檢測(cè)均經(jīng)患者及其家屬同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，LncRNA-BANCR及內(nèi)參GAPDH引物購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa公司，PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

選取患者的腫瘤組織作為研究對(duì)象，同時(shí)選取相應(yīng)的瘤旁組織(3 cm以外)作為對(duì)照。將組織剪碎后，用Trizol試劑提取組織總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系按照SYBR Green說(shuō)明書(shū)配制。內(nèi)參基因設(shè)置為GAPDH。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，隨后 95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。每例設(shè)2個(gè)復(fù)孔，取其平均值。引物及探針序列如下：BANCR上游引物正向：5’-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3’,下游引物反向：5’-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3’。GAPDH上游引物正向：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’GAPDH下游引物反向：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA-3’，BANCR相對(duì)于GAPDH的表達(dá)使用2-△△Ct法計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 隨訪

術(shù)后對(duì)患者10個(gè)月1次的定期隨訪，主要以門診復(fù)查或電話隨訪形式進(jìn)行。總生存(OS)時(shí)間定義為患者自確診腫瘤至死亡或者隨訪截止的時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2019年3月31日，生存期以月為計(jì)數(shù)單位。隨訪的主要內(nèi)容包括患者一般臨床資料，有無(wú)復(fù)發(fā)及生存狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 TNBC腫瘤組織及癌旁組織中BANCR的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，BANCR在TNBC中的表達(dá)水平為(2.512±0.857)，在癌旁組織中的表達(dá)水平為(1.201±0.721)，在癌組織中的表達(dá)水平約是癌旁組織表達(dá)水平2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.666，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 BANCR在癌旁組織及癌組織中表達(dá)水平

2.2 影響TNBC患者BANCR表達(dá)的臨床因素

以BANCR表達(dá)的中位值為臨界值分成兩組：BANCR高表達(dá)組(n=55)和BANCR低表達(dá)組(n=55)，TNBC患者BANCR的表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑及絕經(jīng)狀況無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三陰性乳腺癌患者BANCR表達(dá)的臨床影響因素的分析[n(%)]

2.3 BANCR的表達(dá)與TNBC患者預(yù)后之間的關(guān)系

110例患者均無(wú)失訪，通過(guò)用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，BANCR高表達(dá)組中位生存時(shí)間為36個(gè)月，低表達(dá)組為53個(gè)月，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析比較二者具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)，見(jiàn)圖2。

圖2 BANCR高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后總生存曲線比較

2.4 BANCR的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的單因素及多因素分析

為了探討臨床病理參數(shù)影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，首先將之前統(tǒng)計(jì)的各患者臨床病理參數(shù)與生存率進(jìn)行單因素分析，然后將單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素Cox分析，結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及BANCR高表達(dá)是影響患者術(shù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表2 三陰性乳腺癌患者不同臨床病理參數(shù)與生存率的單變量和多變量分析

3 討 論

乳腺癌治療目前已經(jīng)進(jìn)入分子分型時(shí)代，部分亞型已經(jīng)找到有效治療靶點(diǎn)，三陰性乳腺癌被認(rèn)為是一種難治性乳腺癌，常常見(jiàn)于絕經(jīng)前甚至是更年輕的女性，容易較早出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，是高侵襲、早復(fù)發(fā)的一種乳腺癌分子亞型，因缺乏激素受體的表達(dá)和表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)的表達(dá)，長(zhǎng)久以來(lái)，化療一直是其主要的治療手段。近年來(lái)，免疫治療在三陰型乳腺癌的研究如火如荼，Impassion130研究對(duì)于PD-L1陽(yáng)性的患者應(yīng)用阿替利珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇中位OS達(dá)25個(gè)月，也是目前為止在晚期轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌總生存最長(zhǎng)的研究。但是相較于其他乳腺癌的分子亞型，這個(gè)數(shù)據(jù)顯然并不讓大家滿意。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)對(duì)通路、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等研究了解其生物信息，揭示其分子本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)更具針對(duì)性的、更有效的且毒性更低的診治手段，才能達(dá)到真正意義上的精準(zhǔn)診治和個(gè)體化治療。

近年來(lái)，lncRNA成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)重要的lncRNA(SNHG12、DANCR、ANRIL)[2-4]參與TNBC的發(fā)生與發(fā)展，但絕大多數(shù)lncRNA在TNBC診斷和治療中的作用機(jī)制尚需深入的探索。BANCR定位于9號(hào)染色體上q21.11位點(diǎn)，全長(zhǎng)693 bp，最初是通過(guò)RNA-seq對(duì)致癌基因 BRAF 600E表達(dá)影響的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行篩選而首次被發(fā)現(xiàn)[5]。目前已證實(shí)在多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)。體外細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲除BANCR后顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[6]。He等學(xué)者[7]采用RT-PCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)BANCR在膀胱癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，其過(guò)表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞增殖、侵襲。由此可見(jiàn)，BANCR具有組織特異性。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了BANCR在110例TNBC及癌旁組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BANCR在TNBC中表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。推測(cè)BANCR參與了TNBC的發(fā)生。研究表明BANCR在食管癌中表達(dá)與腫瘤分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。在結(jié)腸癌中，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且是患者預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。本研究通過(guò)分析BANCR在TNBC中表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BANCR與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與其它病理參數(shù)無(wú)關(guān)。推測(cè)BANCR參與了TNBC的發(fā)展。本研究通過(guò)用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，BANCR高表達(dá)組的中位總生存時(shí)間為36個(gè)月，低表達(dá)組則為53個(gè)月，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析比較二者具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。BANCR高表達(dá)組患者生存率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，因此，BANCR在三陰性乳腺癌具有臨床預(yù)后判斷價(jià)值。我們進(jìn)一步通過(guò)單因素及多因素COX分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及BANCR高表達(dá)是影響患者術(shù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。本研究是首次發(fā)現(xiàn)BANCR在三陰性乳腺癌中異常表達(dá)并探討其臨床意義。

三陰性乳腺癌基于基因表達(dá)譜、蛋白組學(xué)等進(jìn)一步又分為不同的亞型，包括雄激素受體型(LAR)、基底樣型(BLIS)、免疫調(diào)節(jié)型(IM)和間質(zhì)型(MES)[10]。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和微陣列技術(shù)的進(jìn)步，我們發(fā)現(xiàn)大量的lncRNA與乳腺癌各種亞型之間存在著密切的關(guān)系[11]。三陰性乳腺癌不同亞型的lncRNA表達(dá)亦存在差異：NR 003221，TCONS 00000027 在間質(zhì)型(MES)和基底樣型(BLIS)表達(dá)高，ENST00000443397主要在免疫調(diào)節(jié)型(IM)中表達(dá)，而ENST00000447908 在雄激素受體型(LAR)中表達(dá)增高[12]。在1 0428例乳腺癌患者NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)整體人群Braf突變頻率為1.3%，而三陰性亞型突變頻率高達(dá)55%。BANCR作為BRAF激活突變后的產(chǎn)物，或是三陰性乳腺癌相較于非三陰型乳腺癌來(lái)說(shuō)相對(duì)特異的lncRNA。

綜上所述，BANCR與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，有望成為潛在治療靶點(diǎn)。本研究為后期細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)我們也會(huì)依托于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及微陣列技術(shù)進(jìn)一步探討在三陰性乳腺癌的不同亞型中BANCR的表達(dá)情況，BANCR在三陰性乳腺癌中的促腫瘤具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。