董照陽(yáng)，胡欣欣，陳茜，魏偉

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）屬于糖尿病常見(jiàn)的微血管病變，也是主要的致盲原因。玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物已在臨床上廣泛使用。雖然抗VEGF藥物在DR的治療中取得了不錯(cuò)的效果，但是也存在術(shù)后不良反應(yīng)的現(xiàn)象[1]。芪明顆粒由成都中醫(yī)藥大學(xué)研制而成，利用現(xiàn)代工藝制藥，在DR治療中廣泛應(yīng)用。該方由8味中藥組成，主要作用包括滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡(luò)明目。根據(jù)目前臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究，都未能精準(zhǔn)明確地指出芪明顆粒治療DR 的有效活性成分、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，從“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”系統(tǒng)地研究中藥與機(jī)體之間的作用機(jī)制，在研究中藥藥效作用中被廣泛應(yīng)用[2]。本次研究擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)芪明顆粒治療DR 作用機(jī)制進(jìn)行探討和研究，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 芪明顆粒相關(guān)活性成分和藥物靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集黃芪、葛根、熟地黃、枸杞子、決明子、蒲黃、茺蔚子、水蛭8 味中藥的化學(xué)成分，以口服吸收利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和成藥性（drug like index，DL）≥0.18 為條件篩選作為篩選參數(shù)，記錄成分的編號(hào)和名稱(chēng)。再通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并應(yīng)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上述靶點(diǎn)名稱(chēng)，確認(rèn)人源靶點(diǎn)，獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2 DR潛在作用靶點(diǎn)的篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)集成大量web 源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫(kù)，它可通過(guò)Gifts算法來(lái)計(jì)算靶點(diǎn)與疾病之間的相關(guān)度，本研究以相關(guān)性分?jǐn)?shù)（Relevance score≥10）作為篩選條件；OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)是用于描述人類(lèi)遺傳病以及基因研究的知識(shí)庫(kù)。本研究通過(guò)GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以“diabetic retinopathy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，獲得與DR 相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將藥物的成分靶點(diǎn)與DR 靶點(diǎn)取交集，得到芪明顆粒治療DR的潛在作用靶點(diǎn)，并上傳至Venny平臺(tái)繪制圖形。將有效化合物與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治鯷3]。網(wǎng)絡(luò)中成分和靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示，成分與靶點(diǎn)之間的相互作用用邊表示。將上述作用靶點(diǎn)結(jié)果輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Homo sapiens”，設(shè)定置信度為0.9，保存結(jié)果為T(mén)SV格式文件。然后使用Cytoscape 構(gòu)建蛋白相互作用（the protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)中心度值（betweenness centrality，BC）、親中心度值（closeness centrality，CC）和等級(jí)值（degree centrality，DC）篩選核心作用靶點(diǎn)，獲得蛋白相互網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)的通路分析

為了進(jìn)一步了解上述靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用，將篩選得到的芪明顆粒作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定閾值P＜0.05，分別進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物學(xué)過(guò)程富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，從而分析藥物治療DR 靶點(diǎn)的主要生物學(xué)過(guò)程和代謝通路，并繪制柱狀圖和表格進(jìn)行可視化分析。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

利用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)主要核心作用靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissDock 在線(xiàn)對(duì)接分析對(duì)接服務(wù)器，獲得對(duì)接評(píng)分，以評(píng)價(jià)芪明顆粒關(guān)鍵化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。

2 結(jié)果

2.1 活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP 篩選和查閱文獻(xiàn)得到活性化合物數(shù)目分別為黃芪20個(gè)，葛根4個(gè)，枸杞子45個(gè)，決明子14個(gè)，蒲黃8個(gè)，茺蔚子0個(gè)，水蛭0個(gè)，去除重復(fù)后，芪明顆粒共有活性成分81 個(gè)。收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt 統(tǒng)一命名）和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)中藥所有靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)篩選并刪除重復(fù)，整合得到作用靶點(diǎn)299個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)的篩選

經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“diabetic retinopathy”獲得相關(guān)的疾病靶點(diǎn)3473 個(gè)，選取相關(guān)度＞10 的靶點(diǎn)共770個(gè)。OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得相關(guān)的疾病靶點(diǎn)216 個(gè)。去除2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)值，最終得到914 個(gè)治療DR 的靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)輸入Venny 軟件繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得疾病靶點(diǎn)-藥物成分共同靶點(diǎn)91個(gè)（圖1）。

圖1 芪明顆粒成分靶點(diǎn)和DR靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 化合物-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及拓?fù)浞治?/h3>

通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建芪明顆粒治療DR化合物一靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，繪制活性成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2）。從圖中可看出同一活性成分可作用于不同靶點(diǎn)，不同活性成分也可作用于同一靶點(diǎn)，由此可見(jiàn)，芪明顆粒多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。通過(guò)Network Analyzer 對(duì)化合物-靶點(diǎn)圖進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取中心度值、親中心度值和等級(jí)值均大于中位數(shù)的核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵有效化合物。研究共篩選出關(guān)鍵活性成分21 種，主要為槲皮素、山奈酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮、黃豆黃素、7-O-甲基異丙醇胺、3'-甲氧基大豆苷元，花生四烯酸，beta-谷甾醇等（表1）。

表1 芪明顆粒關(guān)鍵化合物

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將韋恩圖中成分和疾病共有潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 中，獲得蛋白相互作用，保存其TSV 格式文件。將獲取蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到芪明顆粒對(duì)DR作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。中心度值、親中心度值和等級(jí)值均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（sarcoma gene，Src）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、趨化因子（C-X-C 基序）配體8（Interleukin-8，CXCL8）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、白細(xì)胞介素1B（interleukin 1B，IL-1B）、和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等。這說(shuō)明這些靶點(diǎn)是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用（圖3）。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 芪明顆粒干預(yù)DR的GO富集分析和KEGG富集分析

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID進(jìn)行的GO功能富集分析得到128 個(gè)（P＜0.05）條目。生物過(guò)程條目85 個(gè)，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)缺氧的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等；分子功能條目23 個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、MAP激酶活性、DNA結(jié)合等；細(xì)胞組成條目20個(gè)，主要涉及細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜和質(zhì)膜的外側(cè)、胞質(zhì)溶膠、線(xiàn)粒體等。繪制3 個(gè)模塊條形圖（圖4、5、6）。KEGG通路富集分析得到96條（P＜0.05）信號(hào)通路，主要涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信號(hào)通路、T細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/Akt）和核因子kappa B（nuclear factor kappa-B，NF-kB）信號(hào)通路等。這表明芪明顆粒的有效成分可能通過(guò)作用于這些信號(hào)通路來(lái)達(dá)到治療DR目的（表2）。

圖4 芪明顆粒干預(yù)DR的生物學(xué)過(guò)程分析圖

表2 芪明顆粒治療DR關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，將degree 值最高的前5 位關(guān)鍵化學(xué)成分與5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)分輸入至SwissDock進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證（表3），蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密，F(xiàn)ull Fitness 值越低。成分總分結(jié)果顯示，F(xiàn)ull Fitness 值較低的依次為槲皮素、山柰酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮等。選擇山柰酚與STAT3、JUN、Src、IL6、AKT1 進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示山柰酚與靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性，并且分子構(gòu)象結(jié)合穩(wěn)定（圖7）。

圖7 山奈酚與靶蛋白分子對(duì)接圖

表3 分子對(duì)接結(jié)果

圖5 芪明顆粒干預(yù)DR的細(xì)胞組成分析圖

圖6 芪明顆粒干預(yù)DR的分子功能分析圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為DR 屬于“血灌瞳神”“視瞻昏渺”“螢星滿(mǎn)目”“暴盲”“消渴目病”等范疇[4]。趙艷青等[5]認(rèn)為，本病的病機(jī)為肝腎虧虛，氣陰兩虛；目絡(luò)阻滯，痰瘀互結(jié)。中醫(yī)藥用于對(duì)DR 的臨床研究越來(lái)越受到眼科醫(yī)生和監(jiān)管部門(mén)的高度關(guān)注[6-7]。芪明顆粒方中黃芪益氣生血、通調(diào)血脈，為君藥；葛根生津止渴，通調(diào)血脈，枸杞子滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)精益血，共為臣藥；決明子、茺蔚子、蒲黃、水蛭等活血化瘀、利水消腫、滋肝補(bǔ)腎，共為使藥。諸藥合用共奏滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡(luò)明目之效。

DR 的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、缺氧、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。依據(jù)黃酮類(lèi)化合物的多種生理活性，近年來(lái)大量研究[8]表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)DR有顯著的干預(yù)作用。本研究通過(guò)藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)了21個(gè)關(guān)鍵活性化合物。其中，槲皮素屬于黃酮類(lèi)化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和抗糖尿病的功效[8]，通過(guò)抑制NF-κB 和促進(jìn)半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性發(fā)揮抗ARPE-19 細(xì)胞凋亡的作用，抑制ARPE-19細(xì)胞高糖誘發(fā)的損傷[9]。山奈酚屬于黃酮醇類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性質(zhì)等多種藥理作用[10-11]，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）和血管生成抑制蛋白1（vasohibin-1，VASH1）信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷[12]。水蛭素是一種特異性凝血酶抑制劑，在心腦血管疾病、外科深靜脈血栓、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病等方面并取得了很好的療效[13]，有相關(guān)研究表明，水蛭素通過(guò)抑制STAT3 信號(hào)通路，抑制人腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用[14]。異鼠李素屬于黃芪總黃酮的成分之一，具有內(nèi)皮保護(hù)作用、抗血小板凝集、抗氧化等多種藥理作用[15]。PPI 網(wǎng)絡(luò)表明芪明顆粒多靶點(diǎn)抗DR 的作用特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8、IL-1B、FOS 和EGF 等14 個(gè)靶點(diǎn)作用較強(qiáng)。IL-1B 和IL6 可引起白細(xì)胞聚集，炎癥反應(yīng)，與DR 的發(fā)展關(guān)系密切，其中IL6 通過(guò)上調(diào)VEGF 達(dá)促使新生血管形成并增加血管通透性[16]。MAPK1、MAPK8和MAPK14都是MAPK激酶家族的一員，主要參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和分化等過(guò)程[17-19]，其中MAPK8 在細(xì)胞生存、細(xì)胞死亡、炎癥及其他病理過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用。

為了進(jìn)一步說(shuō)明靶蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了GO 功能富集和KEGG通路富集分析。GO 功能富集結(jié)果顯示，芪明顆粒治療DR 與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控和對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物過(guò)程相關(guān)。由KEGG通路富集分析可知，芪明顆粒治療DR主要通路有TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、癌癥通路、VEGF 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路等。DR 是視網(wǎng)膜長(zhǎng)期處于缺血缺氧狀態(tài)，繼而誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)PDR患者視網(wǎng)膜新生血管的形成[20]，可激活下游PI3K/AKT 通路，可加速內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移、增殖，形成新生微血管腔，最終形成穩(wěn)定的血管[21]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中具有代表性的炎癥因子，通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，激活NF-κB信號(hào)，引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，血管通透性增加，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促進(jìn)DR 的發(fā)生發(fā)展[22]。HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)重要的缺氧信號(hào)蛋白，在高血糖和缺血缺氧狀態(tài)下，誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，其下游重要的靶基因VEGF 也隨之上調(diào)[23]，進(jìn)而調(diào)控血管增生。以上諸條通路涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等，基于此推測(cè)芪明顆粒中的活性成分主要通過(guò)調(diào)控上述多條通路來(lái)發(fā)揮治療DR的作用。

通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證和靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，本研究認(rèn)為STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8 和IL-1B等為核心治療靶點(diǎn)，可被多個(gè)有效化合物作用，并對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生相互影響，表明芪明顆粒對(duì)DR 有直接或間接的治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，芪明顆?？赏ㄟ^(guò)“多靶點(diǎn)-多途徑”治療DR，為芪明顆粒進(jìn)一步深入探討提供了一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為中醫(yī)藥臨床和實(shí)驗(yàn)的研究提供了新方法和新思路。當(dāng)然，本研究的結(jié)論仍存在局限性，只是通過(guò)挖掘數(shù)據(jù)對(duì)芪明顆粒治療DR 的藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，尚需要基礎(chǔ)和臨床藥理試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。