董照陽(yáng),胡欣欣,陳茜,魏偉
糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)屬于糖尿病常見的微血管病變,也是主要的致盲原因。玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物已在臨床上廣泛使用。雖然抗VEGF藥物在DR的治療中取得了不錯(cuò)的效果,但是也存在術(shù)后不良反應(yīng)的現(xiàn)象[1]。芪明顆粒由成都中醫(yī)藥大學(xué)研制而成,利用現(xiàn)代工藝制藥,在DR治療中廣泛應(yīng)用。該方由8味中藥組成,主要作用包括滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡(luò)明目。根據(jù)目前臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究,都未能精準(zhǔn)明確地指出芪明顆粒治療DR 的有效活性成分、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,從“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”系統(tǒng)地研究中藥與機(jī)體之間的作用機(jī)制,在研究中藥藥效作用中被廣泛應(yīng)用[2]。本次研究擬用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)芪明顆粒治療DR 作用機(jī)制進(jìn)行探討和研究,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的參考。
通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集黃芪、葛根、熟地黃、枸杞子、決明子、蒲黃、茺蔚子、水蛭8 味中藥的化學(xué)成分,以口服吸收利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和成藥性(drug like index,DL)≥0.18 為條件篩選作為篩選參數(shù),記錄成分的編號(hào)和名稱。再通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn),并應(yīng)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上述靶點(diǎn)名稱,確認(rèn)人源靶點(diǎn),獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名。
GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)集成大量web 源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫(kù),它可通過Gifts算法來計(jì)算靶點(diǎn)與疾病之間的相關(guān)度,本研究以相關(guān)性分?jǐn)?shù)(Relevance score≥10)作為篩選條件;OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)是用于描述人類遺傳病以及基因研究的知識(shí)庫(kù)。本研究通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,以“diabetic retinopathy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索,獲得與DR 相關(guān)的靶點(diǎn)。
將藥物的成分靶點(diǎn)與DR 靶點(diǎn)取交集,得到芪明顆粒治療DR的潛在作用靶點(diǎn),并上傳至Venny平臺(tái)繪制圖形。將有效化合物與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,繪制化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,并通過Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治鯷3]。網(wǎng)絡(luò)中成分和靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示,成分與靶點(diǎn)之間的相互作用用邊表示。將上述作用靶點(diǎn)結(jié)果輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中,選擇“multiple proteins”模式,蛋白種屬設(shè)為“Homo sapiens”,設(shè)定置信度為0.9,保存結(jié)果為TSV格式文件。然后使用Cytoscape 構(gòu)建蛋白相互作用(the protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)中心度值(betweenness centrality,BC)、親中心度值(closeness centrality,CC)和等級(jí)值(degree centrality,DC)篩選核心作用靶點(diǎn),獲得蛋白相互網(wǎng)絡(luò)圖。
為了進(jìn)一步了解上述靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用,將篩選得到的芪明顆粒作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)定閾值P<0.05,分別進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)生物學(xué)過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析,從而分析藥物治療DR 靶點(diǎn)的主要生物學(xué)過程和代謝通路,并繪制柱狀圖和表格進(jìn)行可視化分析。
利用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢主要核心作用靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu),導(dǎo)入SwissDock 在線對(duì)接分析對(duì)接服務(wù)器,獲得對(duì)接評(píng)分,以評(píng)價(jià)芪明顆粒關(guān)鍵化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。
通過TCMSP 篩選和查閱文獻(xiàn)得到活性化合物數(shù)目分別為黃芪20個(gè),葛根4個(gè),枸杞子45個(gè),決明子14個(gè),蒲黃8個(gè),茺蔚子0個(gè),水蛭0個(gè),去除重復(fù)后,芪明顆粒共有活性成分81 個(gè)。收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt 統(tǒng)一命名)和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)中藥所有靶點(diǎn),經(jīng)過篩選并刪除重復(fù),整合得到作用靶點(diǎn)299個(gè)。
經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“diabetic retinopathy”獲得相關(guān)的疾病靶點(diǎn)3473 個(gè),選取相關(guān)度>10 的靶點(diǎn)共770個(gè)。OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得相關(guān)的疾病靶點(diǎn)216 個(gè)。去除2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)值,最終得到914 個(gè)治療DR 的靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)輸入Venny 軟件繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得疾病靶點(diǎn)-藥物成分共同靶點(diǎn)91個(gè)(圖1)。
圖1 芪明顆粒成分靶點(diǎn)和DR靶點(diǎn)韋恩圖
通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建芪明顆粒治療DR化合物一靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,繪制活性成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)。從圖中可看出同一活性成分可作用于不同靶點(diǎn),不同活性成分也可作用于同一靶點(diǎn),由此可見,芪明顆粒多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。通過Network Analyzer 對(duì)化合物-靶點(diǎn)圖進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,選取中心度值、親中心度值和等級(jí)值均大于中位數(shù)的核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵有效化合物。研究共篩選出關(guān)鍵活性成分21 種,主要為槲皮素、山奈酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮、黃豆黃素、7-O-甲基異丙醇胺、3'-甲氧基大豆苷元,花生四烯酸,beta-谷甾醇等(表1)。
表1 芪明顆粒關(guān)鍵化合物
將韋恩圖中成分和疾病共有潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 中,獲得蛋白相互作用,保存其TSV 格式文件。將獲取蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到芪明顆粒對(duì)DR作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。中心度值、親中心度值和等級(jí)值均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL6)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT1)、酪氨酸蛋白激酶(sarcoma gene,Src)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、趨化因子(C-X-C 基序)配體8(Interleukin-8,CXCL8)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)、白細(xì)胞介素1B(interleukin 1B,IL-1B)、和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF)等。這說明這些靶點(diǎn)是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn),在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用(圖3)。
圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖
通過數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID進(jìn)行的GO功能富集分析得到128 個(gè)(P<0.05)條目。生物過程條目85 個(gè),主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)缺氧的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等;分子功能條目23 個(gè),主要涉及細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、MAP激酶活性、DNA結(jié)合等;細(xì)胞組成條目20個(gè),主要涉及細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜和質(zhì)膜的外側(cè)、胞質(zhì)溶膠、線粒體等。繪制3 個(gè)模塊條形圖(圖4、5、6)。KEGG通路富集分析得到96條(P<0.05)信號(hào)通路,主要涉及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)信號(hào)通路、T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/proteinkinaseB,PI3K/Akt)和核因子kappa B(nuclear factor kappa-B,NF-kB)信號(hào)通路等。這表明芪明顆粒的有效成分可能通過作用于這些信號(hào)通路來達(dá)到治療DR目的(表2)。
圖4 芪明顆粒干預(yù)DR的生物學(xué)過程分析圖
表2 芪明顆粒治療DR關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息
在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中,將degree 值最高的前5 位關(guān)鍵化學(xué)成分與5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)分輸入至SwissDock進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證(表3),蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密,F(xiàn)ull Fitness 值越低。成分總分結(jié)果顯示,F(xiàn)ull Fitness 值較低的依次為槲皮素、山柰酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮等。選擇山柰酚與STAT3、JUN、Src、IL6、AKT1 進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果顯示山柰酚與靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性,并且分子構(gòu)象結(jié)合穩(wěn)定(圖7)。
圖7 山奈酚與靶蛋白分子對(duì)接圖
表3 分子對(duì)接結(jié)果
圖5 芪明顆粒干預(yù)DR的細(xì)胞組成分析圖
圖6 芪明顆粒干預(yù)DR的分子功能分析圖
中醫(yī)認(rèn)為DR 屬于“血灌瞳神”“視瞻昏渺”“螢星滿目”“暴盲”“消渴目病”等范疇[4]。趙艷青等[5]認(rèn)為,本病的病機(jī)為肝腎虧虛,氣陰兩虛;目絡(luò)阻滯,痰瘀互結(jié)。中醫(yī)藥用于對(duì)DR 的臨床研究越來越受到眼科醫(yī)生和監(jiān)管部門的高度關(guān)注[6-7]。芪明顆粒方中黃芪益氣生血、通調(diào)血脈,為君藥;葛根生津止渴,通調(diào)血脈,枸杞子滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)精益血,共為臣藥;決明子、茺蔚子、蒲黃、水蛭等活血化瘀、利水消腫、滋肝補(bǔ)腎,共為使藥。諸藥合用共奏滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡(luò)明目之效。
DR 的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、缺氧、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。依據(jù)黃酮類化合物的多種生理活性,近年來大量研究[8]表明,黃酮類化合物對(duì)DR有顯著的干預(yù)作用。本研究通過藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)了21個(gè)關(guān)鍵活性化合物。其中,槲皮素屬于黃酮類化合物,具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和抗糖尿病的功效[8],通過抑制NF-κB 和促進(jìn)半胱天冬酶-3(Caspase-3)活性發(fā)揮抗ARPE-19 細(xì)胞凋亡的作用,抑制ARPE-19細(xì)胞高糖誘發(fā)的損傷[9]。山奈酚屬于黃酮醇類化合物,具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性質(zhì)等多種藥理作用[10-11],通過促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulatory protein kinase,ERK)和血管生成抑制蛋白1(vasohibin-1,VASH1)信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷[12]。水蛭素是一種特異性凝血酶抑制劑,在心腦血管疾病、外科深靜脈血栓、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病等方面并取得了很好的療效[13],有相關(guān)研究表明,水蛭素通過抑制STAT3 信號(hào)通路,抑制人腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用[14]。異鼠李素屬于黃芪總黃酮的成分之一,具有內(nèi)皮保護(hù)作用、抗血小板凝集、抗氧化等多種藥理作用[15]。PPI 網(wǎng)絡(luò)表明芪明顆粒多靶點(diǎn)抗DR 的作用特點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)中STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8、IL-1B、FOS 和EGF 等14 個(gè)靶點(diǎn)作用較強(qiáng)。IL-1B 和IL6 可引起白細(xì)胞聚集,炎癥反應(yīng),與DR 的發(fā)展關(guān)系密切,其中IL6 通過上調(diào)VEGF 達(dá)促使新生血管形成并增加血管通透性[16]。MAPK1、MAPK8和MAPK14都是MAPK激酶家族的一員,主要參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和分化等過程[17-19],其中MAPK8 在細(xì)胞生存、細(xì)胞死亡、炎癥及其他病理過程中也起著重要的調(diào)控作用。
為了進(jìn)一步說明靶蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用,本研究進(jìn)行了GO 功能富集和KEGG通路富集分析。GO 功能富集結(jié)果顯示,芪明顆粒治療DR 與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控和對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物過程相關(guān)。由KEGG通路富集分析可知,芪明顆粒治療DR主要通路有TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、癌癥通路、VEGF 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路等。DR 是視網(wǎng)膜長(zhǎng)期處于缺血缺氧狀態(tài),繼而誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)上調(diào),促進(jìn)PDR患者視網(wǎng)膜新生血管的形成[20],可激活下游PI3K/AKT 通路,可加速內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移、增殖,形成新生微血管腔,最終形成穩(wěn)定的血管[21]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中具有代表性的炎癥因子,通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體,激活NF-κB信號(hào),引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡,血管通透性增加,破壞血-視網(wǎng)膜屏障,促進(jìn)DR 的發(fā)生發(fā)展[22]。HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)重要的缺氧信號(hào)蛋白,在高血糖和缺血缺氧狀態(tài)下,誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)上調(diào),其下游重要的靶基因VEGF 也隨之上調(diào)[23],進(jìn)而調(diào)控血管增生。以上諸條通路涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等,基于此推測(cè)芪明顆粒中的活性成分主要通過調(diào)控上述多條通路來發(fā)揮治療DR的作用。
通過分子對(duì)接驗(yàn)證和靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,本研究認(rèn)為STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8 和IL-1B等為核心治療靶點(diǎn),可被多個(gè)有效化合物作用,并對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生相互影響,表明芪明顆粒對(duì)DR 有直接或間接的治療作用。
綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,芪明顆??赏ㄟ^“多靶點(diǎn)-多途徑”治療DR,為芪明顆粒進(jìn)一步深入探討提供了一定的科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為中醫(yī)藥臨床和實(shí)驗(yàn)的研究提供了新方法和新思路。當(dāng)然,本研究的結(jié)論仍存在局限性,只是通過挖掘數(shù)據(jù)對(duì)芪明顆粒治療DR 的藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè),尚需要基礎(chǔ)和臨床藥理試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。