鄭大煒，代 巖，郭 娜，黨 強，路 堯，張 鵬，孫 輝，王春俠

(河南省南陽市中心醫(yī)院 呼吸與危重一科，河南 南陽473000)

肺炎鏈球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎的主要原因，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應是肺炎的主要病理變化[1-2]。研究表明中藥具有廣譜抗菌，調節(jié)免疫，簡便價廉等特點，是治療肺炎的良好途徑[3]。通過中藥抑制肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應可有效防治肺炎。蟛蜞菊內酯(Wedelolactone，WEL)是菊科植物墨旱蓮的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化和降血脂等作用[4]。研究報道蟛蜞菊內酯可以減輕過氧化氫引起的血管內皮細胞氧化應激損傷[5]。蟛蜞菊內酯可以通過抑制NF-κB活化，進而減少炎性細胞因子IL-6、TNF-α的生成，從而抑制脂多糖所致的RAW264.7細胞炎癥反應[6]。蟛蜞菊內酯可通過增強PKA信號傳導來促進NLRP3的Ser/Thr磷酸化，從而抑制炎癥小體的活化和凋亡[7]。以上研究表明蟛蜞菊內酯具有顯著的抗炎及抗細胞損傷的作用，然而蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p參與調控炎癥反應及免疫細胞功能，與炎癥性疾病相關，有望成為免疫炎癥性疾病治療的新靶點[8]。miR-142-3p過表達可通過下調Cox-2表達抑制博萊霉素誘導的肺上皮MLE-12細胞凋亡和炎癥[9]。miR-142-3p通過靶向TAB2減輕大腸桿菌衍生的脂多糖誘導的急性肺損傷[10]，miR-142-3p可能參與肺部細胞凋亡、炎癥及損傷等。因此，本實驗旨在研究蟛蜞菊內酯是否通過調控miR-142-3p影響肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料

肺泡上皮細胞A549購自中國科學院細胞庫，肺炎鏈球菌購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；蟛蜞菊內酯(HPLC≥98%)購自上海吉至生化科技有限公司；IL-10、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 細胞處理與分組

肺泡上皮細胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；取對數(shù)生長期A549細胞，將其用1×108CFU/ml的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細胞，作為感染組，不作處理的細胞作為對照組；將10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L蟛蜞菊內酯預處理A549細胞后用1×108CFU/ml的肺炎鏈球菌培養(yǎng)，作為蟛蜞菊內酯低、中、高濃度組(感染組+WEL-L、M、H)；將miR-NC、miR-142-3p轉染至A549細胞后用1×108CFU/ml的肺炎鏈球菌培養(yǎng)，記為感染組+miR-NC組、感染組+miR-142-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-142-3p轉染至A549細胞后用40 μmol/L蟛蜞菊內酯和1×108CFU/ml的肺炎鏈球菌培養(yǎng)，記為感染組+WEL+anti-miR-NC組、感染組+WEL+anti-miR-142-3p組。

1.3 IL-10、IL-6表達的檢測

取1.2中各組細胞，培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測IL-10、IL-6水平，具體步驟按照試劑盒操作進行。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組細胞，用預冷的PBS漂洗，用結合緩沖液重懸，加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻，避光孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，定量，取50 μl蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF上，用5%的牛血清蛋白封閉1 h；加入一抗4℃過夜，加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，加入化學發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析蛋白條帶灰度水平，蛋白表達水平等于目的條帶和GAPDH條帶的比值。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-142-3p表達水平

提取細胞總RNA，合成cDNA后以U6為內參進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-142-3p上游引物序列：5’-TGCGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞炎癥因子表達的影響

與對照組比較，感染組肺泡上皮細胞中IL-10水平降低，IL-6水平升高(P<0.05)；與感染組比較，蟛蜞菊內酯低、中、高濃度組肺泡上皮細胞中IL-10水平升高，IL-6水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)(表1)。

表1 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞炎癥因子表達的影響

2.2 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的影響

與對照組比較，感染組肺泡上皮細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)；與感染組比較，蟛蜞菊內酯低、中、高濃度組肺泡上皮細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的影響

圖1 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的影響

2.3 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞miR-142-3p表達的影響

與對照組比較，感染組肺泡上皮細胞中miR-142-3p表達水平降低(P<0.05)；與感染組比較，蟛蜞菊內酯低、中、高濃度組肺泡上皮細胞中miR-142-3p表達水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)(表3)。

表3 蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞miR-142-3p表達的影響

2.4 miR-142-3p過表達對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的影響

與感染組+miR-NC組比較，感染組+miR-142-3p組miR-142-3p表達水平升高，IL-10水平升高，IL-6水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低(P<0.05)(圖2，表4)。

圖2 miR-142-3p過表達對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的影響

2.5 抑制miR-142-3p表達逆轉了蟛蜞菊內酯(40 μmol/L)對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的作用

與感染組+WEL+anti-miR-NC組比較，感染組+WEL+anti-miR-142-3p組miR-142-3p表達水平降低，IL-10水平降低，IL-6水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)(圖3，表5)。

表4 miR-142-3p過表達對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的影響

分組miR-142-3pIL-10(ng/L)IL-6(ng/mL)凋亡率(%)Bcl-2蛋白Bax蛋白感染組+miR-NC1.00±0.0723.16±2.1966.85±4.0532.31±2.980.21±0.020.57±0.04感染組+miR-142-3p3.15±0.2865.74±4.5331.58±2.8912.67±1.060.61±0.050.27±0.02t22.34825.38821.26718.62822.28320.125P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

圖3 抑制miR-142-3p表達逆轉了蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的作用

表5 抑制miR-142-3p表達逆轉了蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的作用

3 討論

肺炎是臨床常見呼吸系統(tǒng)疾病，肺炎鏈球菌是其主要致病病原菌，肺炎鏈球菌感染可導致肺泡上皮細胞凋亡及分泌炎癥因子，進而參與肺部炎癥反應[11-12]。本實驗用肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞，結果顯示，促炎因子IL-6水平升高，細胞凋亡率升高；證明肺炎鏈球菌可誘導肺泡上皮細胞炎癥損傷。研究報道蟛蜞菊內酯可顯著減少博萊霉素誘導的炎癥細胞浸潤，通過激活AMPK可抑制原代肺成纖維細胞的轉分化和肺泡上皮細胞的上皮間質轉化，進而減輕肺纖維化[13]。蟛蜞菊內酯通過IκK/IκB/NF-κB信號通路減輕了阿霉素誘導的足細胞炎癥和氧化應激[14]。本實驗用不同濃度蟛蜞菊內酯處理肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞，結果顯示，抑炎因子IL-10水平升高，促炎因子IL-6水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性；說明蟛蜞菊內酯可劑量依賴性的抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應，對肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞損傷具有保護作用。

研究報道m(xù)iR-142-3p通過靶向FBXO3減輕人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中的氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的損傷[15]。miR-142-3p可降低TNF-α水平和內皮細胞凋亡[16]。miR-142-3p在肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞中的過表達能夠降低轉化生長因子β受體1(TGFβ-R1)和纖維化基因的表達，具有抗纖維化特性[17]。miR-142-3p過表達抑制了缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡和纖維化[18]。本實驗結果顯示，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞中miR-142-3p表達水平降低；過表達miR-142-3p可降低IL-6水平，提高IL-10水平，降低細胞凋亡率；表明過表達miR-142-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應。此外，蟛蜞菊內酯處理可上調miR-142-3p的表達；抑制miR-142-3p表達逆轉了蟛蜞菊內酯對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的作用。

綜上所述，蟛蜞菊內酯可能通過上調miR-142-3p對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷起保護作用。