楊 帆，何建忠，劉 野

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 病理科，廣東 珠海519000)

緊密連接結(jié)構(gòu)是位于細(xì)胞表面用于連接相鄰細(xì)胞之間的動態(tài)變化結(jié)構(gòu)，緊密連接結(jié)構(gòu)功能的失調(diào)或者破壞導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變，在腫瘤發(fā)生中有極大的影響作用[1]。OCLN作為緊密連接蛋白家族中的一員，發(fā)揮著穩(wěn)定緊密連接結(jié)構(gòu)的作用[2]。相關(guān)研究報道證實，OCLN在非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、腎透明細(xì)胞癌等眾多實體腫瘤中均有異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]，但是目前為止OCLN與膀胱癌的關(guān)系研究甚少。

自噬與腫瘤的關(guān)系十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明。有研究證實，自噬在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮的作用是相互矛盾的，長期抑制自噬會促進(jìn)癌基因表達(dá)；而當(dāng)腫瘤一旦形成，自噬受到抑制時卻可增強(qiáng)藥物治療效率以及減弱腫瘤對藥物的抵抗作用[6-7]。在膀胱癌中，自噬的調(diào)控機(jī)制仍不甚清楚，找到影響膀胱癌自噬的靶標(biāo)有望為膀胱癌治療提供新的思路。

目前針對緊密連接蛋白OCLN與膀胱癌自噬的關(guān)系尚不明確，本研究旨在探討OCLN在膀胱癌中的表達(dá)情況及其對膀胱癌細(xì)胞自噬的影響，為膀胱癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

收集中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院2016年1月至2020年12月病理診斷為膀胱尿路上皮癌的患者37例(其中3例包括對應(yīng)的癌旁組織)?；颊吣挲g范圍41歲至88歲，平均年齡69.48±9.95歲，男女比例17.5∶1，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)膀胱尿路上皮癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第9版； (2)所有患者均在本院接受手術(shù)治療且術(shù)前均未接受放化療治療，臨床分期為Ⅰ期-Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性膀胱癌；(2)既往有放化療史；(3)合并其他部位惡性腫瘤。

1.2 細(xì)胞與主要試劑

T24膀胱癌細(xì)胞及293T細(xì)胞受贈于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院張幸鼎教授課題組，RPMI 1640及DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司， lipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司，qRT-PCR中所需的試劑盒購買于日本Takara公司， P62兔單克隆抗體購買于美國ABClonal公司，LC3B兔多克隆抗體購買于美國Sigma公司，HSP90鼠單克隆抗體及OCLN鼠單克隆抗體購買于ProteinTech公司(武漢)，山羊抗兔及馬抗鼠二抗均購買于美國Cell Signaling Technology(CST)公司。

1.3 實驗儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)； NanoDrop和實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.4 主要方法

1.4.1免疫組化及評分標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化采用二步法，實驗步驟如下：切成石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶后，4℃孵育OCLN一抗過夜(1∶100稀釋)。第2天經(jīng)PBS浸洗后，按照PV9000二抗試劑盒說明書規(guī)范操作孵育二抗，DAB顯色后經(jīng)過蘇木素染色，脫水，最后中性樹脂封片。評分采用組織化學(xué)評分法。

1.4.2OCLN慢病毒構(gòu)建 設(shè)計OCLN相應(yīng)的敲降引物序列，將酶切好的PLKO.1載體與引物通過T4 DNA ligase連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)并涂于氨芐青霉素抗性的LB瓊脂糖平板上，37℃孵育過夜后挑選單克隆菌落，經(jīng)DNA測序確定與Genebank中OCLN基因的敲降序列完全相符，將菌液擴(kuò)增提取質(zhì)粒。所提取的質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒PMD2.G/PSPAX2用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集上清，將上清液3 500 r/min，離心5 min，再用0.45 μm過濾器過濾，得到病毒，-80℃保存，用于后續(xù)實驗。

本文所用引物如下：

shNC正向引物：

5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTT-

CAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTT-

TTG-3′

shNC反向引物：

5′-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAACGTTCGGAG-

AAC-3′

shOCLN-1正向引物：

5′-CGGGCACCAAGCAATGACATATATC-

TCGAGATATATGTCATTGCTTGGTGC TTT-

TTG -3′

shOCLN-1反向引物：

5′-AATTCAAAAAGCACCAAGCAATGAC-

ATATATCTCGAGATATATGTCATTGCTTGG-

TGC -3′

shOCLN-2正向引物：

5′-CCGGGGATGACTATAGAGAAGAAAG-

CTCGAGCTTTCTTCTCTATATCATCCTTTT-

TG -3′

shOCLN-2反向引物：

5′-AATTCAAAAAGGATGACTATAGAGA-

AGAAAGCTCGAGCTTTCTTCTCTATAGTCA-

TCC-3′

1.4.3OCLN過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù) OCLN的基因序列(NCBI Gene ID:100506658)設(shè)計上游引物為5’-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATGTC-

ATCCAGGCCTCTTGA-3’，下游引物為5’-GTCATCCTTGTAATCGAATTCTGTTTTCTGTC-

TATCATAGT-3’。以293T細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與酶切后pcDNA3.1載體連接重組，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)并涂于氨芐青霉素抗性的LB瓊脂糖平板上，37 ℃過夜后，挑選單克隆菌落鑒定為陽性克隆后送DNA測序，與GeneBank中的OCLN基因序列完全相符，之后將菌液擴(kuò)增提取質(zhì)粒，用于后續(xù)實驗。

1.4.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組 T24細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的環(huán)境中貼壁培養(yǎng)。傳代時以2.5×105個/孔的細(xì)胞數(shù)量接種在6孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)將細(xì)胞分為3組，分別用對照組,shOCLN-1和shOCLN-2慢病毒感染，24 h之后，用0.5 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株，后經(jīng)qRT-PCR和Western blot檢測，感染成功的各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書分別配置含有pcDNA3.1-Vector質(zhì)粒和pcDNA3.1-OCLN質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到對照組和過表達(dá)OCLN組的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.5RNA提取及qRT-PCR檢測mRNA的表達(dá) 按照Trizol裂解液說明書步驟提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟反轉(zhuǎn)錄RNA獲取樣本cDNA。采用SYBR Green法對目的基因進(jìn)行相對定量，按照說明書加樣后，將標(biāo)本置于StepOnePlus PCR反應(yīng)儀內(nèi)，反應(yīng)條件為初始變性95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算OCLN,ANKRD37、FLRT2的相對表達(dá)量，引物設(shè)計見表1。

表1 引物設(shè)計

1.4.6OCLN、LC3B及P62蛋白表達(dá)檢測 分組處理后收集細(xì)胞，去掉培養(yǎng)基之后用預(yù)冷的PBS液洗滌，冰上裂解，每10 min振蕩1次，共3次，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，提取總蛋白。后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實驗，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h， P62(1∶1 000)、LC3B(1∶1 000)、OCLN(1∶1 000)、HSP90(1∶5 000)一抗4 ℃過夜；次日，用0.5% PBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗(1∶2 000)1 h，用0.5% PBST同樣條件下洗膜3次，加入顯影液，在化學(xué)顯影儀中曝光。 用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以對照組HSP90為參照，測定各組條帶的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk(S-W)方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布則采用獨立樣本t檢驗比較兩組間均值差異；如果不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)秩和檢驗分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05(雙尾)。當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCLN mRNA及蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析膀胱癌中OCLN mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著膀胱癌病理分期的提高，OCLN表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖1A)。通過對免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，相對于癌旁組織，OCLN蛋白在癌組織的表達(dá)量明顯上升(圖1B)，且隨著膀胱癌病理分期的提高顯著上升(圖1C和表2)。

表2 膀胱癌OCLN蛋白表達(dá)情況與臨床表征的關(guān)系

圖1 OCLN在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

2.2 慢病毒介導(dǎo)OCLN在T24細(xì)胞系中表達(dá)水平檢測

制備的慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞系，通過蛋白印跡法檢測細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，分析其敲降效果(圖1A，B)。結(jié)果顯示，以對照組shNC組作為參照，shOCLN-1組和shOCLN-2組OCLN蛋白的表達(dá)量分別為0.7519±0.1438，0.7319±0.1235，實驗組與對照組間差異明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0037，P=0.0019；通過實時熒光定量法檢測細(xì)胞中的mRNA變化情況，結(jié)果顯示以對照組shNC組作為參照，shOCLN-1組和shOCLN-2組OCLN的mRNA表達(dá)量分別為0.3047±0.05578，0.4789±0.06215，實驗組與對照組間差異明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.0075，P=0.0172(圖2C)。提示慢病毒的沉默效果可信，可以降低人T24細(xì)胞系中OCLN的表達(dá)水平。

圖2 慢病毒介導(dǎo)OCLN在T24細(xì)胞系中低表達(dá)效率檢測

2.3 OCLN在T24細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞自噬水平

首先了解自噬在膀胱癌中的變化情況，通過TIMER2.0(圖3 A)和GEPIA (圖3 B)數(shù)據(jù)庫分析LC3B在膀胱癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在膀胱癌中

LC3B的表達(dá)量低于癌旁組織，膀胱癌中的自噬水平降低。通過免疫印跡法進(jìn)一步驗證，分別檢測穩(wěn)定敲降及過表達(dá)OCLN的T24細(xì)胞系中P62和LC3B的變化水平。結(jié)果顯示，在穩(wěn)定敲降OCLN的T24細(xì)胞系中，shOCLN-1組和shOCLN-2組中的LC3BⅡ/Ⅰ蛋白的比值明顯提高(P=0.0107,P=0.0008),同時P62蛋白的表達(dá)水平降低(P=0.0382,P=0.0327)(圖3C)；而過表達(dá)OCLN后， P62蛋白的表達(dá)水平升高(P=0.0049)，LC3BⅡ/Ⅰ的比值降低(P=0.0238)(圖3D)。以上結(jié)果提示OCLN與膀胱癌自噬關(guān)系密切，且OCLN可以調(diào)控膀胱癌細(xì)胞系T24的自噬水平:敲降OCLN能提高T24細(xì)胞系自噬水平，反之，過表達(dá)OCLN能降低T24細(xì)胞系自噬水平。LC3BⅡ/Ⅰ蛋白灰度分析如圖3 E所示，P62蛋白灰度分析如圖3 F所示。

圖3 OCLN在T24細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞自噬水平

2.4 OCLN影響與自噬相關(guān)ANKRD37基因的表達(dá)

為近一步探究OCLN調(diào)控膀胱癌自噬的機(jī)制，將敲降了OCLN的T24細(xì)胞系進(jìn)行RNA-Seq測序，分析結(jié)果顯示有22個與自噬相關(guān)基因(圖4A)。通過條件篩選之后(P<0.05，F(xiàn)DR<0.01，|log2FC|>1)僅有13個基因(C15orf38-AP3S2,PHOSPHO2-KLHL23,CDC42EP5，GRIP1,FLRT2,GPR160,ANKRD37,NOV,SLC22A15,TENM3，CRELD1，ATF7IP2， MFSD14C)符合篩選條件，其中4個基因(PHOSPHO2-KLHL23，CDC42EP5， SLC22A15， MFSD14C)與OCLN無相關(guān)性，2個基因(C15orf38-AP3S2,NOV)未能在數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)。為了進(jìn)一步驗證，采用qRT-PCR檢測分別敲降和過表達(dá)OCLN之后在T24中剩余基因的表達(dá)情況，僅有ANKRD37和FLRT2兩個基因在敲降了OCLN之后細(xì)胞中的表達(dá)較穩(wěn)定(圖4 B)，其余基因未做展示；但在過表達(dá)OCLN之后的T24細(xì)胞系中檢測發(fā)現(xiàn)FLRT2的表達(dá)效果不穩(wěn)定，這部分未做展示。OCLN與ANKRD37相關(guān)性分析見圖4 C。qRT-PCR結(jié)果顯示OCLN敲降組ANKRD37的表達(dá)水平低于對照組(P=0.0108,P=0.0183)(圖4 Bii)，OCLN過表達(dá)組的ANKRD37表達(dá)水平高于對照組(P=0.0238)(圖4 D)，說明ANKRD37可能為OCLN調(diào)控的自噬相關(guān)的下游基因。

圖4 OCLN影響與自噬相關(guān)ANKRD37基因的表達(dá)

3 討論

膀胱癌是我國常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在所有腫瘤中發(fā)病率居第9位[8]，男性發(fā)病率和死亡率均高于女性[9]，是造成我國男性患者死亡的第六大因素[10]。目前，根據(jù)臨床病理分期，臨床上主要采取卡介苗BCG膀胱內(nèi)灌注免疫治療，手術(shù)切除以及以順鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)藥物治療[11-12]，但是由于對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，在40年的治療隨訪中，5年生存率僅提高了5%-8%，且不良反應(yīng)較多[13]。因此，通過研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點是亟待解決的問題。

緊密連接蛋白與多種腫瘤關(guān)系密切，研究表明，緊密連接結(jié)構(gòu)在不同腫瘤中發(fā)揮著不同作用[14-15]。作為第1個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接家族成員，OCLN在穩(wěn)定緊密連接結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用的同時也與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切。OCLN在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞極性消失，提示OCLN可能是引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的重要蛋白[16]。在肺癌中，OCLN通過AKT/PI3K通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，抑制了OCLN的表達(dá)之后肺癌細(xì)胞的增殖也受到抑制[17]。而OCLN與膀胱癌的關(guān)系及其作用機(jī)制目前研究甚少。本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌中OCLN mRNA的表達(dá)與膀胱癌病理分期密切相關(guān)。為了進(jìn)一步證實OCLN與膀胱癌的關(guān)系，本研究通過免疫組化染色，對37例膀胱癌臨床樣本的OCLN蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCLN蛋白水平的表達(dá)隨著膀胱癌病理分期的提高而上升。

目前大量研究證實自噬與腫瘤密切相關(guān)且作用復(fù)雜。自噬是一種腫瘤抑制機(jī)制，臨床上目前使用的許多抗癌藥物會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，同時自噬也作為某些抗癌藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制[18-19]。也有研究表明自噬可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，例如缺氧的腫瘤組織會誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)這些惡性腫瘤細(xì)胞的存活，導(dǎo)致放療化療不敏感[20]。自噬與膀胱癌的關(guān)系目前研究較少，Liu[21]等研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤相關(guān)的自噬基因beclin1的表達(dá)在膀胱癌中與患者的臨床分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，在膀胱癌中自噬受到抑制。也有研究證實，激活了膀胱癌細(xì)胞的自噬后，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而起到治療腫瘤的作用[22]。

目前為止，OCLN調(diào)節(jié)自噬在腫瘤，尤其在膀胱癌中的作用未見報道。本文就OCLN對膀胱癌自噬的影響進(jìn)行探討性研究。首先通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，高級別的膀胱癌組織中OCLN表達(dá)水平高于低級別的膀胱癌組織，同時LC3B在癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織。那么OCLN與膀胱癌的自噬作用是否存在一定相關(guān)性，為了證實這一推測，首先通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別敲降和過表達(dá)T24細(xì)胞系中的OCLN，并通過Western blot實驗檢測P62，LC3B的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，敲降OCLN之后，P62蛋白表達(dá)量降低，LC3BⅡ/Ⅰ的比值增大，提示在T24中敲降了OCLN的表達(dá)之后，細(xì)胞自噬增強(qiáng)；相反，過表達(dá)OCLN 之后，P62表達(dá)升高，LC3BⅡ/Ⅰ的比值下降，細(xì)胞自噬受到抑制。通過以上實驗結(jié)果表明OCLN是調(diào)控膀胱癌自噬的重要蛋白。

為了進(jìn)一步探討OCLN調(diào)控自噬的機(jī)制，通過對敲降OCLN的T24細(xì)胞系進(jìn)行RNA-Seq測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在敲降OCLN之后的T24細(xì)胞系中，其與自噬相關(guān)的基因也發(fā)生相應(yīng)的變化，其中變化最顯著的是Ankyrin repeat domain protein(ANKRD)。在腸癌中ANKRD37的異常高表達(dá)與腸癌患者的不良預(yù)后呈明顯正相關(guān)，在調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的癌細(xì)胞自噬中發(fā)揮著重要作用[23]。通過qRT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，在敲降OCLN之后的T24細(xì)胞系中，ANKRD37mRNA水平顯著下降，而在過表達(dá)OCLN的T24中，ANKRD37mRNA水平明顯升高，因此推測ANKRD37可能是OCLN影響膀胱癌自噬的重要靶基因。

綜上所述，OCLN在膀胱癌中高表達(dá)，抑制OCLN的表達(dá)可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的自噬作用，進(jìn)而影響了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，而ANKRD37可能是OCLN影響膀胱癌自噬作用的重要靶基因。