丁 昂，谷從紀(jì)，衣盛月，阮亞男，張奇瑞，夏振遠(yuǎn)，陳澤斌*

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214； 2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021)

煙草黑脛病是烤煙生產(chǎn)過(guò)程中的主要真菌性病害之一，且分布非常廣泛[1]，其病原菌煙草寄生疫霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)對(duì)煙草的危害極大，會(huì)導(dǎo)致無(wú)法挽回的經(jīng)濟(jì)損失．而研究煙草黑脛病菌生理小種的判別及鑒別寄主的篩選有助于明確黑脛病原生理分化情況，進(jìn)而為煙草黑脛病的防治提供理論依據(jù)．1896年，煙草黑脛病首次在印尼爪哇煙草中發(fā)現(xiàn)[2]；1950年，在我國(guó)黃淮煙區(qū)也發(fā)現(xiàn)了該病，之后蔓延至其他煙區(qū)[3-8]．隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其研究的深入，愈來(lái)愈多研究者發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病的致病性并不是相對(duì)穩(wěn)定的．例如：Lucas[9]報(bào)道了一個(gè)弱致病力菌系，隨后有研究者也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌在致病力上存在一定的差異；1957年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者[6]開始對(duì)煙草黑脛病的生理?；赃M(jìn)行研究；1962年，Apple[10]把對(duì)N.plumbagitnifolia無(wú)致病力的菌系定為0號(hào)小種，高度致病力的菌系定為1號(hào)小種；其他研究者發(fā)現(xiàn)，煙草黑脛病菌0號(hào)小種對(duì)L8、NC1071、N.nudicaulis、N.plumbaginifolia和K326無(wú)致病力或僅有弱致病力，但對(duì)小黃金1025具有一定致病力．此外，我國(guó)生理小種的分布研究開始于20世紀(jì)80年代，0號(hào)生理小種主要分布在我國(guó)的山東省、貴州省、云南省、湖北省、河南省、陜西省、安徽省、福建省、湖南省、四川省，1號(hào)生理小種主要分布在我國(guó)的遼寧省[11]．1973年，Lamprecht等[12]采用類似方法，以Delcrest202煙草品種接種后的不同反應(yīng)，在南非鑒定出2號(hào)小種；1978年，Mclntyre等[13]選用幾種特定煙草品種并結(jié)合某些培養(yǎng)性狀和生理生化特性，在美國(guó)將康涅狄格菌系0號(hào)和1號(hào)生理小種區(qū)分開來(lái)，定為3號(hào)生理小種．截至目前，煙草疫霉菌在全世界已發(fā)現(xiàn)的生理種有0、1、2、3號(hào)[14]．此外，李梅云[15]、李斌等[16]、苗圃等[17]主要通過(guò)TTZ顏色反應(yīng)、TTC顏色反應(yīng)和鑒別寄主法鑒別黑脛病菌生理小種類型．而本研究擬采用菌絲塊無(wú)創(chuàng)傷貼接法來(lái)判別黑脛病菌生理小種類型及致病性，旨在為抗病育種、栽培和植物保護(hù)等方面控制該病害提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 供試菌種

煙草黑脛病菌由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表菌株QJS804(分離自曲靖市師宗縣五龍鄉(xiāng)樣品)、BSSDD6(分離自保山市施甸縣萬(wàn)興鄉(xiāng)樣品)、CXSL(分離自楚雄州雙柏縣大莊樣品)、DLXY(分離自大理州祥云縣禾甸鎮(zhèn)樣品)、CXLT(分離自楚雄州祿豐縣仁興鎮(zhèn)樣品)、YXJHD(分離自玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)樣品)、YXHN06(分離自玉溪市紅塔區(qū)高倉(cāng)鎮(zhèn)樣品)、DCWS03(分離自迪慶州香格里拉市上江鄉(xiāng)樣品)、eXSBD40(分離自昭通市巧家縣老店鎮(zhèn)樣品)、gh2(分離自臨滄市耿馬縣勐永鎮(zhèn)樣品).

1.2 供試品種

鑒別寄主：L8、NC1071、Florida301、小黃金1025；對(duì)照烤煙品種：紅花大金元、K326、KRK26、NC82．以上烤煙品種均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供．

1.3 培養(yǎng)基制備

稱取燕麥片30 g，加入600 mL水，沸水浴上加熱并不斷攪拌1 h，雙層紗布過(guò)濾，棄掉過(guò)濾物，濾液備用．稱取瓊脂粉17～20 g置于1 000 mL燒杯中，加入200 mL水，玻璃棒攪拌均勻，與濾液充分混勻，加水補(bǔ)足1 000 mL，趁熱分裝滅菌，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min.

1.4 煙苗準(zhǔn)備

將L8、NC1071、Florida301、小黃金1025、紅花大金元、K326、KRK26、NC82這8個(gè)品種放入漂浮盤進(jìn)行育苗，在播種1個(gè)月時(shí)剪去葉片的1/2以上，7 d后進(jìn)行第2次剪葉，剪葉7 d后移栽至溫室大棚培養(yǎng)．

1.5 黑脛病病菌接種體制備

挑取甘油管中保存的10個(gè)菌株各1環(huán)，接種在燕麥培養(yǎng)基平板中間，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，將活化的黑脛病菌置于燕麥培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接種5皿，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.

1.6 煙苗移栽

將煙苗移栽至裝有栽培土的花盆中，并放置于溫室大棚中，定期澆水．設(shè)置8個(gè)處理，每個(gè)處理6株，3次重復(fù).

1.7 黑脛病菌接種

將燕麥培養(yǎng)基中的黑脛病菌菌絲用無(wú)菌解剖刀分割成4 mm×4 mm小塊，將菌絲塊貼接于煙苗的莖基部，菌絲塊用脫脂棉包裹住，并向脫脂棉滴加少量蒸餾水，使其完全濕潤(rùn)，以保證菌絲體正常生長(zhǎng)，并設(shè)置培養(yǎng)基塊接種作對(duì)照[18].

1.8 病情調(diào)查

接種3 d后，以株為單位調(diào)查并記錄各煙株發(fā)病情況，共調(diào)查14 d．病害嚴(yán)重度分級(jí)及調(diào)查方法參照國(guó)標(biāo)《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》(GB/T 23222—2008)[19]進(jìn)行．

1.9 生理小種鑒別

通過(guò)分析各鑒別寄主的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)(簡(jiǎn)稱病指)，公式如下：

根據(jù)煙草品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)[20]判斷抗感性，其中：高抗或免疫(HR)，病指為0；抗病(R)，病指為0.1～20；中抗(MR)，病指為20.1～40；中感(MS)，病指為40.1～60；感病(S)，病指為60.1～80；高感(HS)，病指為80.1～100．黑脛病菌生理小種的劃分參照表1．

表1 不同生理小種在鑒別寄主上的反應(yīng)

2 結(jié)果與分析2.1 黑脛病菌侵染不同品種煙株的發(fā)病情況

將鑒別寄主L8、小黃金1025、Florida301、NC1071被不同黑脛病菌侵染后的致病情況列入表2．由表2可看出，鑒別寄主被黑脛病菌侵染后分別表現(xiàn)出不同的感病情況，其中：L8對(duì)編號(hào)為1、2、3、4、5、8、9的黑脛病菌表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為6、7、10的黑脛病菌表現(xiàn)為抗病；小黃金1025對(duì)10個(gè)黑脛病菌全部表現(xiàn)為感?。籉lorida301除對(duì)編號(hào)為9的黑脛病菌表現(xiàn)為感病外，對(duì)其他9個(gè)黑脛病菌表現(xiàn)為抗病；NC1071對(duì)編號(hào)為1、2、3、4、5、8的黑脛病菌表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為6、7、9、10的黑脛病菌表現(xiàn)為抗病.

表2 鑒別寄主被不同黑脛病菌侵染后的致病情況

續(xù)表2

2.2 黑脛病菌生理小種的判別

不同黑脛病菌對(duì)鑒別品種的抗感性統(tǒng)計(jì)列入表3．由表3可知，10個(gè)黑脛病菌鑒定為2個(gè)不同的生理小種，其中6個(gè)菌株為1號(hào)生理小種，4個(gè)菌株為0號(hào)生理小種．屬于黑脛病1號(hào)生理小種的菌株有：DCWS03、CXLT、DLXY、CXSL、QJS804、BSSDD6，屬于0號(hào)生理小種的有g(shù)h2、eXSBD40、YXHN06、YXJHD.

表3 不同黑脛病菌對(duì)鑒別品種的抗感性統(tǒng)計(jì)

2.3 黑脛病菌對(duì)不同栽培品種煙株的發(fā)病情況

栽培品種KRK26、紅花大金元、NC82、K326在不同黑脛病菌侵染下的致病情況列入表4．由表4可看出，不同栽培品種被黑脛病菌侵染后分別表現(xiàn)出不同的感病情況，其中：KRK26對(duì)編號(hào)為1、5、6、8、9、10的黑脛病菌表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為2、3、4、7的黑脛病菌表現(xiàn)為抗病；紅花大金元對(duì)10個(gè)黑脛病菌全部表現(xiàn)為感病；NC82對(duì)編號(hào)為1、3、6、7、8、10的黑脛病菌表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為2、4、5、9的黑脛病菌表現(xiàn)為抗??；K326對(duì)編號(hào)為1、2、5、8、9、10的黑脛病菌表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為3、4、6、7的黑脛病菌表現(xiàn)為抗病.

2.4 栽培品種中黑脛病菌鑒別寄主的篩選

通過(guò)對(duì)比表2和表4栽培品種和鑒別寄主被黑脛病菌侵染后的感病情況，發(fā)現(xiàn)栽培品種紅花大金元與鑒別寄主小黃金1025的感病情況一致，因此可將紅花大金元作為感病品種用于黑脛病菌0號(hào)和1號(hào)生理小種的鑒定．

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

作為判別黑脛病菌生理小種類別的鑒別寄主需要具備的條件有：鑒別能力、抗感分明、反應(yīng)靈敏穩(wěn)定、重復(fù)性好[21]．根據(jù)國(guó)內(nèi)外鑒定黑脛病菌生理小種類型的試驗(yàn)來(lái)看，本試驗(yàn)選用的4個(gè)鑒別寄主L8、小黃金1025、Florida301、NC1071具有明顯的鑒別能力，從其發(fā)病情況可以直觀地判別黑脛病菌生理小種類型，滿足試驗(yàn)需求.

表4 不同黑脛病菌在栽培品種上的致病情況

分析不同黑脛病菌侵染煙草栽培品種后的感病情況，發(fā)現(xiàn)KRK26對(duì)編號(hào)為6、9、10的0號(hào)生理小種和編號(hào)為1、5、8的1號(hào)生理小種均表現(xiàn)為感病，對(duì)編號(hào)為7的0號(hào)生理小種和編號(hào)為2、3、4的1號(hào)生理小種均表現(xiàn)為抗?。甆C82及K326在不同黑脛病菌侵染后均呈現(xiàn)與KRK26一樣的發(fā)病情況，因此不可將這3個(gè)栽培品種作為鑒別寄主.

通過(guò)對(duì)比表1、表2和表3可以發(fā)現(xiàn)，鑒別寄主L8和Florida301對(duì)編號(hào)為9的0號(hào)黑脛病菌生理小種表現(xiàn)為感病，該結(jié)論與黑脛病菌生理小種的劃分結(jié)果(參照表1)不符．由此可見，菌絲塊無(wú)創(chuàng)傷貼接法可能受外界條件影響，致使煙株表現(xiàn)出不同的感病情況．例如K326、NC82會(huì)對(duì)不同類型的生理小種表現(xiàn)出不同的感抗性，因此不同黑脛病菌生理小種侵染這兩個(gè)抗病品種后會(huì)表現(xiàn)出不同的感病情況．近年來(lái)，分子生物學(xué)方法極大地幫助了生理小種的鑒定[22]．因此，有必要將分子生物學(xué)與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，才能對(duì)煙草黑脛病菌生理小種進(jìn)行更加深入的研究.

3.2 結(jié)論

采用菌絲塊無(wú)創(chuàng)傷貼接法對(duì)10個(gè)黑脛病菌進(jìn)行生理小種判別結(jié)果表明，6個(gè)菌株屬于1號(hào)生理小種，4個(gè)菌株屬于0號(hào)生理小種．栽培烤煙品種KRK26、NC82、K326在被10個(gè)不同黑脛病菌侵染后均未呈現(xiàn)出感病癥狀，而栽培品種紅花大金元與鑒別寄主小黃金1025的發(fā)病情況一致，因此可以將紅花大金元用于黑脛病菌0號(hào)和1號(hào)生理小種的鑒定．