查艷景，楊本壽，左 祥

(1.曲靖醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655000； 2.曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 微生物研究所，云南 曲靖 655000)

農(nóng)業(yè)是我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的基礎(chǔ)，而畜牧業(yè)作為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，受到國家有關(guān)部門的高度重視．據(jù)報(bào)道[1]，我國每年的糧食增長(zhǎng)幅度有限，導(dǎo)致家禽飼料短缺，阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展，造成家禽產(chǎn)量需求與飼料供應(yīng)之間形成了一種供需落差，因此飼料已成為影響家禽飼養(yǎng)的重要問題．而探討生物活性次生代謝產(chǎn)物在家禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用是解決該問題的一種有效途徑．次生代謝產(chǎn)物是植物適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的一種常規(guī)現(xiàn)象，也是植物、生物以及非生物因素等多種作物相互作用的結(jié)果[2]．目前，國外一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)在生物活性次生代謝產(chǎn)物的研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展，且研究主要集中在生物產(chǎn)量、生物活性中的抗逆性和抗蟲性等性狀層面，并根據(jù)研究成果建立了相對(duì)應(yīng)的資源檔案和數(shù)據(jù)庫[3]．

國內(nèi)對(duì)生物活性次生代謝產(chǎn)物的研究起步較晚，最初是由我國的生物科研院所和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院等一些機(jī)構(gòu)開展研究．近年來，對(duì)于該領(lǐng)域的研究已經(jīng)形成了一定規(guī)模．例如：文獻(xiàn)[4]根據(jù)葡萄渣多酚抗氧化、抗菌和抗炎等生物特征，描述了葡萄渣多酚的生物活性作用，并分析了在生物生產(chǎn)上的應(yīng)用[4]；文獻(xiàn)[5]介紹了?；撬嵩谏镅饬x上的功能，主要是保護(hù)生物細(xì)胞以及保證生物的循環(huán)代謝等，同時(shí)總結(jié)了?；撬嵩诩仪萆a(chǎn)中應(yīng)用場(chǎng)景[5]．目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于將生物活性次生代謝產(chǎn)物應(yīng)用到家禽飼養(yǎng)生產(chǎn)方面的研究?jī)?nèi)容還不夠全面，需要深入探討.

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

在家禽飼料價(jià)格不斷上漲的背景下，新飼料資源逐漸成為家禽飼養(yǎng)的主要研究對(duì)象．為探討生物活性次生代謝產(chǎn)物對(duì)家禽飼養(yǎng)的影響，試驗(yàn)以小麥葉片為研究對(duì)象，并進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)試．試驗(yàn)用藥品和試劑如表1所示，器材見表2.

表1 藥品與試劑

表2 儀器和器材

續(xù)表2

1.2 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

以小麥葉片作為生物活性次生代謝產(chǎn)物的試驗(yàn)樣品，設(shè)置植物水分、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)及磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為試驗(yàn)指標(biāo)[6]．

試劑配制過程：用電子天平稱取33.05 g的磷酸二氫鈉，定容至800 mL，靜置15 min，生成0.15 mol的溶液，設(shè)定為溶液A；稱取72.86 g磷酸氫二鈉，定容至800 mL，靜置10 min，生成0.15 mol的溶液，設(shè)定為溶液B．將25 mL的溶液A與75 mL的溶液B混合，再加入500 mL的蒸餾水與其充分混合，生成0.89 mol酸堿值為7.1的磷酸鹽緩沖液[7]．取850 mL的清水，并將80 g的鎢酸鈉和40 g的磷鉬酸溶解于水中，待充分溶解后再倒入容量為1.5 L的燒杯內(nèi)，搖勻后加入 55 mL 的磷酸，再接入冷凝管，將燒杯放置在沸水浴上加熱并回流1.5 h，待完全冷卻后加500 mL的水并稀釋，生成F-D試劑[8]．向磨口回流瓶中加入120 g鎢酸鈉和30 g鉬酸鈉．準(zhǔn)備850 mL的蒸餾水、78%的磷酸、85～120 mL濃鹽酸，用文火回流8.5 h[9]．然后將冷凝器取下，隨后加入硫酸鋰與蒸餾水混合搖勻后，再加入液體溴7～9滴．將蒸餾水煮沸，20 min后，觀察并輕嗅溶液的顏色和味道，直至溶液從綠色變?yōu)辄S色．若溶液中仍然呈現(xiàn)出綠色，根據(jù)綠色的鮮艷程度，重復(fù)上述步驟2～3次．待溶液完全冷卻后，定容至1 200 mL，并將過濾后的溶液倒入避光瓶中保存[10].

指標(biāo)測(cè)定：測(cè)定植物水分利用烘干法快速水分測(cè)定儀測(cè)定；粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)用凱氏定氮儀測(cè)定；粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)用酸堿洗滌法測(cè)定，采用碳酸鈉、氫氧化鈉及高錳酸鉀進(jìn)行洗滌，去除植物溶劑降解產(chǎn)物，完成粗纖維測(cè)定．其余指標(biāo)的測(cè)定方法如表3所示.

表3 測(cè)定指標(biāo)及方法

稱取10 g樣品，倒入200 mL的燒杯中，再添加10%的三氯乙酸溶液80 mL，充分混合后靜置 8 min，采用干過濾方法過濾溶液，去除初始濾液[11]．將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 200 r/min下，離心15 min，將上清液倒入消化管，進(jìn)行粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定．此外，還需檢測(cè)樣品中的粗纖維、粗灰分、鈣、磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12]．并用下面的公式計(jì)算生物發(fā)酵物中的小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，將小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為試驗(yàn)的參照指標(biāo)，進(jìn)行下一步驟．

(1)

式中：Q表示生物發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為%；N表示鹽酸的濃度，單位為mol/L；A1表示測(cè)定過程中，消耗的鹽酸溶液的體積，單位為mL；A2表示測(cè)定過程中，空白試驗(yàn)所消耗的鹽酸溶液的體積，單位為mL；e表示樣品的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為%；l表示樣品質(zhì)量，單位為g．

1.3 提取并分離次生代謝產(chǎn)物

壓縮濾液至黏稠狀，利用等體積的石油醚脫油3～5次，再采取用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)3～5次后得到發(fā)酵液酯提浸膏的減壓濃縮狀態(tài)；待菌絲體陰干后，用乙酸乙酯超聲提取2～3次；利用薄層色譜法(TLC)比較兩部分浸膏的成分差異，檢測(cè)后減壓濃縮得到40 g的最終浸膏．提取流程如圖1所示．

圖1 次生代謝產(chǎn)物提取與分離流程

根據(jù)圖1次生代謝產(chǎn)物的提取與分離流程，將提取、分離到的不同質(zhì)量的化合物，進(jìn)行TLC檢測(cè)并加入碘粉和5%的硫酸乙醇溶液，得到最終的化合物.

1.4 計(jì)算樣品生物活性

將小麥葉片培養(yǎng)12 h后，采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，用無菌液體培養(yǎng)基配制成含菌量為1×108的菌懸溶液．稱量3 mg樣品，配置成質(zhì)量濃度為 2.2 mg/mL 的樣品溶液[13]．然后利用無菌水分別稀釋成濃度為10.25，22.50，50.00，75.00，100.00 μmol/L 的溶液，加入等量的菌懸液充分搖勻后，重復(fù)上述步驟，直至達(dá)到最小抑制濃度值．生物活性以清除生物有機(jī)自由基的能力為衡量標(biāo)準(zhǔn)，而這種生物有機(jī)自由基，外觀呈現(xiàn)紫色，在波長(zhǎng)為510～520 nm處能使顏色變淡直至褪色[14]，并且其接受電子與褪色程度之間呈現(xiàn)相應(yīng)的定量關(guān)系．將5 mL的溶液與3 mL的 180 μmol/L 的甲醇溶液混合并搖勻[15]．保證室內(nèi) 45 min 無光條件反應(yīng)下，在510 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，并按照下面公式計(jì)算，則得到試驗(yàn)樣品的生物活性數(shù)值．

(2)

式中：R表示清除DPPH的半數(shù)抑制率；X0表示 5 mL 甲醇與2 mL 180 μmol/L的DPPH的吸光度值；X1表示8 mL樣品與2 mL 180 μmol/L的 DPPH 混合反應(yīng)后的吸光度值；X2表示8 mL的樣品與1 mL甲醇的吸光度值．

1.5 檢測(cè)家禽飼料成分特征設(shè)定應(yīng)用范圍

飼料是家禽獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，飼料的質(zhì)量直接影響家禽的生長(zhǎng)發(fā)育．因此，必須檢測(cè)家禽飼料中的成分特征，并設(shè)定生物活性次生代謝產(chǎn)物在家禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用范圍．通常情況下，家禽飼料中主要以植物的莖葉和籽實(shí)作為飼料的原材料．依據(jù)常規(guī)無菌操作流程，將次生代謝產(chǎn)物的試驗(yàn)樣品洗凈晾干后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡 1 min 后，再用無菌水漂洗3次，將其放置在無菌濾紙上吸干水分，備用．將植物葉片分割成 0.75 cm×0.75 cm的塊狀，并將其放置在含有氯霉素與鏈霉菌的新鮮培養(yǎng)基中．培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度設(shè)置為25.5 ℃，3 d為1個(gè)周期，培養(yǎng)兩個(gè)周期．培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)比家禽飼料的物質(zhì)成分和試驗(yàn)樣品的成分，得到檢測(cè)結(jié)果．家禽飼料的主要成分如表4所示．

表4 家禽飼料的主要成分

由表4可知，家禽飼料的主要成分中，維生素B、脂肪和胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低．而在生物活性次生代謝產(chǎn)物中，除富含碳水化合物之外，還包括單糖、雙糖以及半纖維素、纖維素以及淀粉等物質(zhì)．此外，家禽飼料不僅受提取工藝的影響較大，飼料中的非脂固物質(zhì)、揮發(fā)性脂肪酸的比例以及乳鐵蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)還不同程度地受次生代謝產(chǎn)物的影響．

綜上，根據(jù)家禽的品種等信息，將生物活性次生代謝產(chǎn)物應(yīng)用到飼料制作過程中，通過提取并分離次生代謝產(chǎn)物、計(jì)算樣品生物活性以及檢測(cè)家禽飼料成分特征設(shè)定應(yīng)用范圍，則可得到試驗(yàn)結(jié)果．

2 結(jié)果與分析

在不同的質(zhì)量條件下，測(cè)試生物活性次生代謝產(chǎn)物對(duì)家禽采食速率的影響，結(jié)果如表5所示．不同質(zhì)量下次生代謝產(chǎn)物對(duì)家禽采食速率的影響詳見圖2．

表5 家禽采食速率均值

圖2 不同質(zhì)量下次生代謝產(chǎn)物對(duì)家禽采食速率的影響

從表5和圖2可知，在相同的次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量條件下，分別對(duì)比家禽在3個(gè)時(shí)間段的采食速率，當(dāng)次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為50 g時(shí)，家禽在3個(gè)時(shí)段內(nèi)的采食速率均值為50.81 g/h；而在25，75，100 g的質(zhì)量條件下，家禽在3個(gè)時(shí)段的采食速率均值分別是21.25，43.57，42.47 g/h．表明當(dāng)生物活性次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為50 g時(shí)，家禽在3個(gè)時(shí)間段的采食速率均值均高出其他質(zhì)量條件下的采食速率均值．由此得出，生物活性次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為50 g時(shí)，最適宜應(yīng)用到家禽的飼料制作中．

3 討論與結(jié)論

1)由本試驗(yàn)結(jié)果可知，生物活性次生代謝產(chǎn)物與家禽飼料之間存在直接關(guān)聯(lián)．當(dāng)生物次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為25 g時(shí)，其3個(gè)時(shí)段采食速率均值為21.25 g/h；當(dāng)生物次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為50 g時(shí)，其3個(gè)時(shí)段采食速率均值為50.81 g/h；當(dāng)生物次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為100 g時(shí)，其3個(gè)段采食速率均值為42.47g/h．由此可知，當(dāng)生物活性次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量為50 g時(shí)，為制作家禽飼料的最佳應(yīng)用方案．

2)探討生物活性次生代謝產(chǎn)物在家禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用，不僅能提高家禽飼料的轉(zhuǎn)化率，還能緩解糧食供求緊張的局面．除此之外，加入生物活性代謝產(chǎn)物的家禽飼料具有更高的營養(yǎng)價(jià)值，在一定程度上降低了飼養(yǎng)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益，有利于家禽飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展．并為改善家禽飼養(yǎng)的生物條件提供了多元化的技術(shù)手段，具有較好的應(yīng)用前景．但由于研究條件有限，對(duì)于生物活性次生代謝產(chǎn)物在家禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用，今后還需深入研究.