荊贊革，呂 葉，裴徐梨，焦 鵬，朱麗瑞，楊四玉

(昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院，云南 昆明 650214)

分子標記是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映．目前，應用較普遍的有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等分子標記．此外，簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性(ISSR)分子標記技術也廣泛應用于品種鑒定[1]、遺傳多樣性分析[2]、基因定位[3]、植物基因組作圖以及指紋圖譜建立[4]．例如：陳桂平等[5]利用ISSR標記對無花果品種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)引物811F和836F可特異性將2號和20號種質(zhì)資源區(qū)分出來；王慶軍等[6]對觀賞石榴進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳變異較大，存在較豐富的遺傳多樣性；Kojima等[7]利用分子標記構建了小麥品種的遺傳連鎖圖，發(fā)現(xiàn)多個ISSR位點可被定位到染色體上；邵雪花等[8]采用ISSR標記對余甘子品種的遺傳多樣性進行了分析和指紋圖譜建立，發(fā)現(xiàn)只需引物UBC809和引物UBC886就可成功區(qū)分廣東省的28份余甘子種質(zhì)資源．

嫩食型南瓜主要以嫩瓜作為食用對象，深受消費者的喜愛．但是，嫩食型南瓜栽培品種由于地區(qū)間相互引種、自繁自育等原因，導致一些地方資源種源混雜，種性退化嚴重等問題，給資源搜集和新品種育種造成較大困難[9]．因此，本研究利用ISSR分子標記技術對搜集到的嫩食型南瓜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，鑒定其親緣關系，以期為嫩食型南瓜的利用和新品種選育及育種提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以收集的多份不同類型的嫩食型南瓜品種為試驗材料，具體名稱見表1．

1.2 DNA的提取和引物篩選

種子催芽后進行穴盤育苗，待長到四葉一心時，使用植物基因組DNA提取試劑盒(Takara)提取葉片DNA．

ISSR引物根據(jù)已公布序列隨機挑選合成．篩選出條帶清晰、重復性好的引物，用于后續(xù)試驗．

表1 用于ISSR標記分析的材料

1.3 ISSR-PCR反應和檢測

PCR擴增程序為95 ℃變性 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存；擴增體系為DNA模板1.5 μL，引物1 μL，2×Mix 10.0 μL，ddH2O補足20 μL．通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測．

1.4 凝膠電泳產(chǎn)物檢測與統(tǒng)計分析

根據(jù)遷移率不同，在同一位點有條帶的標記為“1”，無條帶的標記為“0”．利用NTsys2.10e軟件進行聚類分析．

2 結果

2.1 ISSR-PCR擴增結果分析

本試驗共篩選出17條擴增條帶清晰、重復性較好的引物(表2)．這些引物共擴增出99條帶，每個引物平均擴出條帶為5.82條，多態(tài)性條帶為97條，多態(tài)性比例為97.79%．其中：引物ISSR14和ISSR17擴增出的帶數(shù)最多，為10條；ISSR18擴增出的帶數(shù)則最少，只有4條，其中3條為多態(tài)性條帶．圖1顯示了ISSR22引物擴增產(chǎn)物的電泳結果．

2.2 嫩食型南瓜品種聚類分析

利用分子標記檢測數(shù)據(jù)構建親緣關系聚類圖(圖2)．結果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.74處，把嫩食型南瓜材料分為兩大類(圖2)．第1大類包含27份材料，其中：21(小青瓜)和22(精選七葉瓜)均來自山西，親緣關系較近，位于同一個小的分支；1(淺花)和5(早喜一號)的親緣關系很近，聚在一起，而3(珍玉四號F1)親緣關系則與來自同一省份的1(淺花)稍遠，但三者仍然聚在同一個小分支中；7(玉玲)、9(白花皮一串鈴)、10(一串金二號)、12(一串鈴花籃)、21(小青瓜)和22(精選七葉瓜)的遺傳相似系數(shù)均在0.874以上，位于同一個大的分支．第2大類包含28[西葫蘆(晶瑩粹)]、29(黃皮筍瓜)，30(黑籽南瓜)、31(黃瓜)和32(西瓜)，這5份外群材料與嫩食型南瓜的親緣關系較遠．

圖1 ISSR22引物擴增電泳結果

表2 ISSR 引物擴增及其結果統(tǒng)計

圖2 嫩食型南瓜材料聚類分析圖

3 討論

遺傳多樣性是物種進化的本質(zhì)，對于遺傳多樣性研究有助于種質(zhì)資源的保護和利用[6]．前人已經(jīng)使用不同的分子標記手段對南瓜的遺傳多樣性進行了分析，如：朱海生等[10]使用ISSR分子標記技術分析了南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)6對引物中共獲得條帶125條，多態(tài)性比例為92%；朱白婢等[11]利用4對ISSR分子標記共擴增出條帶63條，多態(tài)性條帶有60條，多態(tài)性比例為93.38%．而本試驗通過ISSR-PCR擴增出多態(tài)性條帶比例為97.79%，如此高比例的多態(tài)性，可能是由于幾個外群親緣關系與南瓜相差太遠所致．

本研究通過親緣關系分析把嫩食型南瓜分為兩個大類，分析結果顯示，嫩食型南瓜品種間差異較明顯，南瓜品種間遺傳變異率較高．從聚類圖可以看出，部分不同來源的一些種質(zhì)資源聚在同一類群，其原因可能是由于栽培過程中相互引種，從而導致不同地區(qū)的種質(zhì)資源親緣關系較近．而有些(同一來源的)品種沒有聚在一起，可能是由于本試驗采用的ISSR分子標記太少，未能真實反映其親緣關系．本試驗結果說明，嫩食型南瓜種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性，有利于物種適應環(huán)境．因此，嫩食型南瓜引種時要充分考慮各種影響因素，才能更明確其親緣關系，保持更為豐富的遺傳多樣性．