闞玉紅，謝筆鈞，孫智達(dá)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

番石榴(PsidiumguajavaL.)，又名雞矢果、拔子，屬桃金娘科(Myrtaceae)、番石榴屬(Psidium)，是多年生的常綠灌木植物。番石榴葉為番石榴的干燥葉及帶葉嫩枝，具有抗菌、降血糖、收斂止瀉、消炎止血等功效[1-3]。黃酮類化合物是番石榴葉中的重要生物活性成分，具有良好的抗氧化、抗菌、抗癌等藥理活性[4-6]。

食品防腐劑是指為提高食物的品質(zhì)或者延緩由微生物、酶解和氧化引起的食品降解，而添加到食物中的天然物質(zhì)或化學(xué)合成物質(zhì)[7-8]。食品領(lǐng)域中常采用的化學(xué)防腐劑，如山梨酸鹽、亞硝酸鹽和苯甲酸鹽等，其中有的對(duì)人體健康有一定的不良影響[9]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者們?cè)絹碓疥P(guān)注食品安全問題，尤其是微生物導(dǎo)致的食物腐敗和化學(xué)添加劑帶來的毒害作用。因此，尋找天然、綠色和安全的防腐劑已成為研究者們關(guān)注的熱門課題。有研究表明，將天然防腐劑添加在食品中，可延長(zhǎng)食品的保藏時(shí)間[10-12]。

本研究使用胭脂紅番石榴葉為原料，提取其中的黃酮類化合物并鑒定其成分；通過測(cè)定抑菌率、MIC和MBC、生長(zhǎng)殺滅曲線評(píng)價(jià)番石榴葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用；通過細(xì)胞壁通透性實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分析、蛋白質(zhì)滲漏、胞內(nèi)ROS水平分析和掃描電鏡(SEM)觀察探究其抑菌機(jī)制。該研究對(duì)進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用番石榴葉提供了有價(jià)值的研究，同時(shí)也為打開番石榴葉黃酮提取物作為天然防腐劑市場(chǎng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂紅番石榴葉：購自福建漳州；無水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等(均為國(guó)產(chǎn)分析純)：購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)：美國(guó)Fisher公司；金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌ATCC51659：從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購得。

VCX750超聲破碎儀 美國(guó)索尼克斯公司；UV-2100型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Thermo Scientific Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Thermo Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司；WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；CW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；激光FACSVerse分析型流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；HTX多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)寶特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取和純化

1.2.1.1 超聲輔助提取總黃酮

稱取80 g胭脂紅番石榴葉粉末，按料液比1∶10(g/mL)加入75%的乙醇溶液，設(shè)定超聲功率為150 W，超聲波占空比為6，超聲時(shí)間為35 min。提取完成后在7000×g下離心10 min，收集上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)40 ℃減壓去除乙醇并濃縮，得到番石榴葉黃酮粗提液50 mL。

1.2.1.2 總黃酮的純化

將上述黃酮粗提液負(fù)載于AB-8大孔樹脂上，采用20倍量蒸餾水進(jìn)行洗脫，以除去水溶性雜質(zhì)，隨后用70%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi) 40 ℃減壓除去乙醇,再進(jìn)行冷凍干燥[13]，得到番石榴葉黃酮提取物4.83 g(以下簡(jiǎn)稱RGLF)。

1.2.2 總黃酮得率和純度的測(cè)定

采用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量，根據(jù)李培源等[14]的方法稍作修改。配制0.5 mg/mL的黃酮溶液，吸取0.3 mL黃酮溶液于10 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.2 mL，混勻后于室溫放置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.2 mL，混勻后于室溫放置6 min，隨后加入5% NaOH溶液1 mL，用乙醇溶液定容至5.0 mL，混勻放置15 min，采用紫外可見分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光值。

配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法顯色后測(cè)定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定黃酮濃度，并計(jì)算純度。得率和純度計(jì)算公式如下：

1.2.3 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物組成的鑒定

以甲醇為溶劑，將凍干的番石榴葉黃酮提取物粉末配制成0.5 mg/mL的樣品溶液，使用 0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)行組分分析。色譜柱：ZORABX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序見表1，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積為10.0 μL[15]。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 The mobile phase gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，在負(fù)離子模式下，噴霧電壓為3200 V，毛細(xì)管溫度為300 ℃，鞘氣(氮?dú)?為40 L/h，輔助氣體(氮?dú)?流速15 L/h，氣化溫度為350 ℃，S-Lens射頻水平為50%，離子掃描范圍在50～1500 m/z。

1.2.4 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的抑菌活性評(píng)價(jià)

1.2.4.1 抑菌率的測(cè)定

抑菌實(shí)驗(yàn)采用96孔板微量肉湯培養(yǎng)基二倍稀釋法[16]。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種活化好后，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ù_定稀釋倍數(shù)，調(diào)節(jié)菌液濃度為108CFU/mL。配制濃度為2.5 mg/mL的樣品溶液，使用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為106CFU/mL。以青霉素作為陽性對(duì)照，將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，于全波長(zhǎng)讀數(shù)儀上測(cè)定其吸光值(OD600 nm)。

式中：As為不同濃度樣品吸光值；A0為空白對(duì)照吸光值。

1.2.4.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定

根據(jù)美國(guó)臨床和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)會(huì)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[17]。以青霉素作為陽性對(duì)照，將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的 MIC。根據(jù)MIC 結(jié)果，在上述培養(yǎng)24 h后的96孔板中每孔取100 μL于MH固體培養(yǎng)基中，用滅菌接種環(huán)輕推藥液，將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落作為受試菌的MBC。

1.2.4.3 生長(zhǎng)殺滅曲線的繪制

采用時(shí)間殺滅曲線研究抗菌藥物濃度對(duì)96孔板中細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。根據(jù)1.2.4.1中的方法配制樣品溶液，調(diào)節(jié)菌液濃度并在96孔板中加樣培養(yǎng)。將96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔2 h測(cè)定一次吸光值(OD600 nm)。

1.2.5 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的抑菌機(jī)制研究

1.2.5.1 對(duì)細(xì)胞壁通透性的影響

參照周先漢和李橋妹的方法并作部分修改[18-19]。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為108CFU/mL，向菌液中加入黃酮樣品，使樣品終濃度為2 MIC，并在37 ℃恒溫水浴搖床中振蕩培養(yǎng)。分別在30，60，90，120，150 min時(shí)取樣，于510 nm處測(cè)定吸光值，平行測(cè)定3次，取平均值，同時(shí)在相同條件下以不加黃酮樣品作為對(duì)照。

1.2.5.2 PI染色實(shí)驗(yàn)

用流式細(xì)胞儀測(cè)定經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色的細(xì)菌的染色率來評(píng)估樣品溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的膜通透性的損傷效應(yīng)[20]。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×108CFU/mL，向菌液中加入樣品液，使其終濃度為0.5 MIC并在37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)。在40 min時(shí)取樣，用無菌生理鹽水清洗菌體2次，隨后加入1 mL濃度為10 μg/mL的PI染料，于4 ℃避光染色30 min。離心棄去上清液，使用無菌生理鹽水清洗菌體以除去殘余染料。清洗完全的菌體使用生理鹽水重懸，迅速于流式細(xì)胞儀上測(cè)定PI染色率。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)滲漏實(shí)驗(yàn)

使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定經(jīng)樣品處理過的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中的蛋白質(zhì)滲漏量[21]。按1.2.5.2中的方法進(jìn)行加樣處理，在 37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)，分別在 2，4，6，8，10，12 h時(shí)離心取上清液測(cè)吸光值。使用牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)滲漏量。

1.2.5.4 胞內(nèi)ROS分析

根據(jù)Ning等[22]測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的方法作部分修改。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×109CFU/mL，按1.2.5.2中的方法進(jìn)行加樣處理，在 37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)，在不同時(shí)間段取樣，用生理鹽水洗滌2次，將1 mL 10 μg/mL DCFH-DA溶液添加到細(xì)菌細(xì)胞中，于37 ℃避光染色30 min,用生理鹽水清洗菌體，除去殘余染料。隨后用生理鹽水重懸菌體并加入到96孔板中，通過多功能酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞內(nèi) ROS 的相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFI)(Ex 485 nm/Em 528 nm)。

1.2.5.5 RGLF對(duì)細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×108CFU/mL，按1.2.5.2中的方法進(jìn)行加樣處理，使其終濃度為0.5 MIC并在37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)10 h。用生理鹽水清洗2次后迅速加入2.5%戊二醛固定液，在4 ℃條件下固定4 h。用生理鹽水清洗菌體3次，將菌體依次置于30%、50%、70%乙醇水溶液中進(jìn)行梯度脫水。將脫水完成的菌體進(jìn)行冷凍干燥處理。取適量菌體粘于AI臺(tái)的導(dǎo)電膠上，鍍金后放入掃描電鏡腔室內(nèi)進(jìn)行觀察[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin 8.6和 Excel 2016進(jìn)行處理,采用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析(p<0.05),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物純度和得率測(cè)定

將黃酮粗提液經(jīng)大孔樹脂純化，結(jié)果表明：AB-8大孔樹脂對(duì)番石榴葉黃酮提取物有較強(qiáng)的純化富集作用，70%乙醇洗脫能得到純度較高的產(chǎn)物,最終超聲輔助提取法得到番石榴葉黃酮的純度為85.58%，得率為6.04%。

2.2 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析

使用Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，以ESI作為離子源在負(fù)離子模式下對(duì)番石榴葉黃酮提取物化學(xué)組成進(jìn)行分析。將所得質(zhì)譜特征與文獻(xiàn)報(bào)道值進(jìn)行比較，同時(shí)化合物所測(cè)得的分子量的實(shí)驗(yàn)值與理論值的相對(duì)誤差均小于5×10-6，從而確定了樣品中化合物的組成，結(jié)果見表2。

表2 四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析番石榴葉中的組分Table 2 The analysis of components in the leaves of Psidium guajava L. by quadrupole-orbital well high resolution mass spectrometry

續(xù) 表

這些化合物中有12種(1，2，4～13號(hào))先前已由Díaz-de-Cerio等從番石榴葉中鑒定出[24]，3號(hào)化合物先前已由Elixabet Díaz-de-Cerio等通過HPLC-DAD-QTOF-MS從番石榴葉中鑒定出[25]，在本文中通過高分辨質(zhì)譜分析得到了驗(yàn)證。

化合物4的分子離子峰[M-H]-為289.0720，保留時(shí)間在4.46 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為245.0815 [M-CO2]-，203.0709[M-2C2H2O-2H]-，179.0342[M-C6H6O2]-，125.0233(C環(huán)1，4鍵斷裂)m/z ，與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)并依據(jù)分子量相對(duì)誤差值(0.48×10-6)，鑒定該化合物為兒茶素[26]，分子式是C15H14O6。

化合物13的分子離子峰[M-H]-為301.0357，保留時(shí)間在27.40 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為178.9979，151.0028 m/z，其質(zhì)譜特征與槲皮素的一級(jí)、二級(jí)碎片完全一致，且分子量相對(duì)誤差值為0.99×10-6，可確定該物質(zhì)是槲皮素[27]，分子式為C15H10O7。

化合物9，10，11的分子離子峰[M-H]-分別為433.0780，433.0781和433.0782，保留時(shí)間分別在18.30，19.08，20.66 min，并分別產(chǎn)生m/z為301.0342，301.0329和301.0345的槲皮素碎片片段，這些碎片離子對(duì)應(yīng)于槲皮素-戊糖苷中戊糖苷部分的缺失(即433～132 Da)，由此可知，這3個(gè)化合物均為槲皮素-戊糖苷，根據(jù)文獻(xiàn)中所報(bào)道的出峰順序及分子量相對(duì)誤差(分別為0.92×10-6，1.13×10-6，1.20×10-6)，推測(cè)這3種化合物為槲皮素-戊糖苷的異構(gòu)體，分別是瑞諾苷、番石榴苷和扁蓄苷，分子式是C20H18O11。

化合物6的分子離子峰[M-H]-為449.0730，保留時(shí)間在13.08 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為316.0226(為碎片離子m/z 317.0276-H)，317.0276(為準(zhǔn)分子離子[M-H]-丟失戊糖基)m/z，即449.0703～132 Da。碎片離子271.0251[M-H-C6O6H10]-m/z即449.0703～178 Da，根據(jù)Chang Chi-Huang 等前期鑒定的結(jié)果及分子量相對(duì)誤差值(0.99×10-6)，推測(cè)該化合物為楊梅素-阿拉伯糖苷/吡喃木糖苷異構(gòu)體[28]，分子式是C20H18O12。

化合物8的分子離子峰[M-H]-為463.0888，保留時(shí)間在16.79 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為301.0345，300.0276，178.9979，151.0027 m/z。其中301.0345 m/z對(duì)應(yīng)于槲皮素-己糖苷中己糖苷部分(162 Da)的缺失，300.0276 m/z為碎片離子脫去一個(gè)氫(即301.0345-H)，碎片離子178.9979，151.0027 m/z為槲皮素的特征碎片離子。因此，確定該化合物為槲皮素-己糖苷，根據(jù)文獻(xiàn)中所報(bào)道的出峰順序及分子量相對(duì)誤差值(1.44×10-6)，推測(cè)該物質(zhì)是異槲皮苷，分子式是C21H20O12。

化合物7的分子離子峰[M-H]-為477.0678，保留時(shí)間在16.60 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片301.0355，151.0027 m/z為該化合物的特征碎片，其中碎片301.0355 m/z為該化合物丟失葡萄糖醛酸基，即[M-C6O6H9]-，碎片151.0027 m/z為槲皮素的特征碎片，上述結(jié)果與文獻(xiàn)[24]和文獻(xiàn)[28]報(bào)道的一致，且分子量相對(duì)誤差為0.79×10-6，故鑒定該物質(zhì)為槲皮素-葡萄糖醛酸苷，分子式是C21H18O13。

化合物5的分子離子峰[M-H]-為479.0835，保留時(shí)間在12.42 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為317.0274([M-H-162]-)，316.0224，271.0249 m/z，除317.0274 m/z中性損失162己糖部分，形成楊梅素糖苷配基，其余的碎片離子與化合物6相同，且其分子量相對(duì)誤差為0.73×10-6，因此推測(cè)該化合物是楊梅素-己糖苷異構(gòu)體[29]，分子式是C21H20O13。

化合物2的分子離子峰[M-H]-為577.1357，保留時(shí)間在3.30 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為425.0887，407.0777，289.0720，125.0233 m/z，其中289 m/z對(duì)應(yīng)于兒茶素或(表)兒茶素，407 m/z表明兩個(gè)亞基之間存在4β-6連接，且其分子量相對(duì)誤差為1.13×10-6，因此將該化合物鑒定為兒茶素或(表)兒茶素-兒茶素或(表)兒茶素連接的B型原花青素二聚體，分子式是C30H26O12。

化合物12的分子離子峰[M-H]-為585.0894，保留時(shí)間在22.84 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為433.0779，301.0346，283.0474，169.0134 m/z ，碎片301.0346 m/z為該化合物的準(zhǔn)分子離子(M-H)失去一個(gè)戊糖基和沒食子酰基的槲皮素苷元的碎片離子峰[(M-H)-132-152]-，283.0474 m/z為槲皮素苷元脫去一個(gè)中性水分子所形成的碎片離子峰[(M-H)-132-152-H2O]-，根據(jù)參考文獻(xiàn)及分子量相對(duì)誤差(-0.89×10-6)，推測(cè)該物質(zhì)是Guavinoside C(quercetin 3-O-(5″-O-galloyl)-alpha-L-arabinofuranoside，即槲皮素3-O-(5″-O-沒食子?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖苷)[30-31]，分子式是C27H22O15。

化合物1的分子離子峰[M-H]-為593.1309，保留時(shí)間在2.93 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片分別為425.9880，289.0723 m/z ，對(duì)應(yīng)于(表)兒茶素與(表)沒食子兒茶素或沒食子兒茶素連接的二聚體，其分子量相對(duì)誤差為-1.46×10-6，與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)該物質(zhì)是原飛燕草素二聚體異構(gòu)體，分子式是C30H26O13。

化合物3的分子離子峰[M-H]-為745.1417，保留時(shí)間在3.36 min，對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片為 593.1312，575.1203，423.0724，305.0669 m/z，根據(jù)Jaiswal等提出的MS/MS碎片模式及分子量相對(duì)誤差(0.92×10-6)，推測(cè)該化合物為沒食子?；?表)兒茶素-(表)沒食子兒茶素連接的二聚體[32]，分子式是C37H30O17。

由以上結(jié)果可知，番石榴葉黃酮提取物中除了含有槲皮素及其糖苷外，還含有原花青素和楊梅素糖苷等物質(zhì)。

2.3 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用

2.3.1 抑菌率的測(cè)定

RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率見圖1。

圖1 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(A)、大腸桿菌ATCC51659(B)的抑制率Fig.1 The inhibition rates of RGLF on S. aureus CMCC(B)26003 (A)and E. coli ATCC51659 (B)

由圖1可知，RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003和大腸桿菌EscherichiacoliATCC51659均有抑制作用。對(duì)于金黃色葡萄球菌，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)RGLF對(duì)其的抑制率均為100%；而對(duì)于大腸桿菌，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率也隨之增大，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系(p<0.05)，當(dāng)樣品濃度為1.25 mg/mL時(shí)，RGLF對(duì)大腸桿菌ATCC51659的抑制率可達(dá)到90%以上，且IC50為0.103 mg/mL，青霉素在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)兩種菌的抑制率均為100%；以上結(jié)果表明RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力比大腸桿菌強(qiáng)，這與Farhana Jasmin Ara 等[33]的研究結(jié)果一致。

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MBC值見表3。

表3 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌ATCC51659的MIC和MBC值Table 3 The minimum inhibition concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration (MBC)values of RGLF on S. aureus CMCC(B)26003 and E. coli ATCC51659

將RGLF對(duì)兩種細(xì)菌的MIC和MBC值進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)RGLF作用于兩種細(xì)菌后對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值最低，表明RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力要強(qiáng)于大腸桿菌，這與抑菌率所得出的結(jié)果一致。

2.3.3 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響

RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響見圖2。

由圖2可知，RGLF對(duì)其生長(zhǎng)周期均有一定的影響，表現(xiàn)為延滯期變長(zhǎng)，而對(duì)數(shù)期變短或消失。隨著樣品濃度的增大，RGLF對(duì)兩種菌的抑制能力也越來越強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度為0.156 mg/mL時(shí)可以完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)；當(dāng)樣品濃度為1.25 mg/mL時(shí)可以阻止大腸桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，完全抑制其生長(zhǎng)。因此，RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用優(yōu)于大腸桿菌。

圖2 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(a)、大腸桿菌ATCC51659(b)生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 The effect of RGLF on the growth curves of S. aureusCMCC(B)26003(a)and E. coli ATCC51659(b)

2.4 胭脂紅番石榴葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌機(jī)制分析

2.4.1 對(duì)細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶位于細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的間隙之中，正常情況下不會(huì)向外分泌，但當(dāng)細(xì)胞遭到破壞后，其會(huì)泄露到細(xì)胞外，因此可以通過檢測(cè)細(xì)胞外酶的變化反映細(xì)胞壁通透性的變化[34-35]。RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響見圖3。

圖3 金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)堿性磷酸酶含量的變化Fig.3 The changes of alkaline phosphatase content ofStaphylococcus aureus (a)and Escherichia coli (b)

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，空白對(duì)照組的堿性磷酸酶含量無明顯變化，而加了黃酮樣品的菌懸液胞外堿性磷酸酶含量先增加后變平穩(wěn)。處理時(shí)間在30，150 min時(shí)，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組在510 nm處的吸光值分別為0.143和0.221；大腸桿菌在510 nm處的吸光值分別為0.563和0.681，二者OD值的變化可能是因?yàn)镽GLF與細(xì)菌已作用完全，故后期堿性磷酸酶含量無明顯變化。

2.4.2 PI染色實(shí)驗(yàn)

經(jīng)RGLF處理后兩種菌體 PI 熒光染色鏡檢結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在初始濃度、培養(yǎng)時(shí)間均相同的情況下，對(duì)照組的PI染色率較低(金黃色葡萄球菌為4.93%，大腸桿菌為4.77%)，有極少部分細(xì)菌被染色，一方面是因?yàn)榫w自身凋亡引起；另一方面是因?yàn)橐徊糠只钚暂^弱的菌體在環(huán)境條件變化的情況下主動(dòng)激活某些基因的表達(dá)和調(diào)控，導(dǎo)致菌體死亡[36]。經(jīng)RGLF處理后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的PI染色率明顯增加，表明有較多的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜遭到破壞，從而使PI染料能夠進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部。金黃色葡萄球菌的PI染色率為90.6%，大腸桿菌的PI染色率為25.8%，說明RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌有較高的抑制活性，這與上面得到的研究結(jié)果一致。

圖4 RGLF處理金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的PI染色分析Fig.4 PI staining analysis of Staphylococcus aureus and Escherichia coli treated with RGLF注：橫坐標(biāo)表示通道的熒光信號(hào)值，縱坐標(biāo)表示熒光信號(hào)值對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。

2.4.3 蛋白質(zhì)滲漏實(shí)驗(yàn)

經(jīng)RGLF處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)滲漏量的變化見圖5。蛋白質(zhì)是維持細(xì)菌菌體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)，當(dāng)菌體細(xì)胞膜被破壞時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)滲漏到細(xì)胞外，因此可以通過測(cè)定胞外蛋白質(zhì)含量來反映RGLF對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用。

圖5 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)蛋白滲漏量的影響Fig.5 The effect of RGLF on the protein penetration amount of Staphylococcus aureus(a)and Escherichia coli(b)

由圖5可知，經(jīng)RGLF處理2 h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的蛋白滲漏量分別為20.43，322.10 μg/mL，當(dāng)處理時(shí)間為12 h時(shí)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的蛋白滲漏量分別達(dá)到35.10，345.27 μg/mL，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外蛋白質(zhì)滲漏得越多，細(xì)菌細(xì)胞膜被大量破壞，致使細(xì)胞膜的穿透性變大，大分子蛋白質(zhì)能泄露到細(xì)胞外，且金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)速率較快，經(jīng)樣品處理6 h后，大腸桿菌的蛋白質(zhì)滲漏量趨于平緩。

2.4.4 胞內(nèi)ROS分析

經(jīng)RGLF處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS的變化見圖6。熒光染料DCFH-DA用于分析和定量ROS的產(chǎn)生，用于研究細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化及氧化應(yīng)激水平。

圖6 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)胞內(nèi)ROS強(qiáng)度的影響Fig.6 The effect of RGLF on the intracellular ROS intensity of Staphylococcus aureus (a)and Escherichia coli (b)

由圖6可知，在同一樣品濃度下，經(jīng)RGLF培養(yǎng)后，細(xì)菌細(xì)胞中以時(shí)間依賴的方式檢測(cè)到熒光強(qiáng)度的增加。與空白對(duì)照組相比，樣品組在細(xì)胞中產(chǎn)生了大量的ROS，當(dāng)處理時(shí)間為0.5 h時(shí)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS強(qiáng)度較弱，分別為22.67和88.00；當(dāng)處理時(shí)間為2.5 h時(shí)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS強(qiáng)度分別高達(dá)54.67和148.67。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在金黃色葡萄球菌細(xì)胞中ROS強(qiáng)度的增加幅度比大腸桿菌大，說明RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響比大腸桿菌大，胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增加，從而達(dá)到了抑菌的作用。

2.4.5 SEM分析

通過電子掃描電鏡觀察了RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，見圖7。

圖7 RGLF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 The effect of RGLF on the morphological structure of Staphylococcus aureus and Escherichia coli

圖7中A為未經(jīng)樣品處理的金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)，其菌體細(xì)胞大小一致，呈葡萄狀排列；圖7中B為經(jīng)RGLF處理過的菌體形態(tài)，其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞，因此細(xì)胞大小不一，且出現(xiàn)了不同程度的皺縮。圖7中C為正常狀態(tài)下的大腸桿菌菌體形態(tài)，呈現(xiàn)典型的桿狀，兩端呈鈍圓形；圖7中D為加樣處理后的菌體形態(tài)，其發(fā)生了大面積的凹陷，有些細(xì)胞壁發(fā)生了破裂，內(nèi)容物滲漏。這些觀察結(jié)果表明RGLF可引起細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌能夠造成明顯的內(nèi)部損傷。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取法提取胭脂紅番石榴葉總黃酮的得率為6.04%，提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂進(jìn)一步純化后，所得樣品純度可達(dá)85.58%，表明AB-8大孔樹脂對(duì)番石榴葉黃酮有較好的純化效果，且超聲輔助提取法不失為一種較理想的方法。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析，并與參考文獻(xiàn)比對(duì)及分子量相對(duì)誤差計(jì)算，從番石榴葉黃酮提取物中共鑒定出13種酚類化合物，包括槲皮素及其糖苷、楊梅素糖苷和兒茶素及原花青素二聚體等。番石榴葉黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有良好的抑制作用，其機(jī)制是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和在胞內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS，致使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激而達(dá)到優(yōu)良的抑菌效果。在我國(guó)人工合成防腐劑的使用占大多數(shù)，若使用不當(dāng)，對(duì)人類的身體有一定的毒害作用，而胭脂紅番石榴葉黃酮提取物有較好的抑菌效果，因此，可以將其開發(fā)為綠色防腐劑，應(yīng)用在日常調(diào)味品中，既能增加食物的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，又能達(dá)到防腐保鮮作用。