羅佳沂，李洋，楊琪，李慧敏，覃麗，毛瑞豐，李凱

(廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004)

紅曲霉菌屬是一種小型絲狀腐生真菌，1884年由Van Tieghem命名[1]，具有良好的耐酸和耐乙醇能力。紅曲霉不僅可以釀造紅曲酒、烹飪飲食、發(fā)酵食品[2-4]，同時，它的代謝產(chǎn)物Monacolin K具有降低膽固醇和防止心血管疾病的活性物質(zhì)[5]，在我國已有超過千年的使用歷史。紅曲米是以秈稻為原料，接種紅曲霉菌發(fā)酵而成的棕紅色或紫紅色不規(guī)則顆粒。在我國有些地方也稱之為“丹曲”、“赤曲”、“紅米”等[6-7]。大多數(shù)學者以大米為發(fā)酵基質(zhì)做紅曲米，也有少數(shù)學者使用玉米粒、糙米等[8]。根據(jù)紅曲米的用途不同，可將其分為三大類別：輕曲、庫曲、色曲。

我國紅曲產(chǎn)品主要分布在福建、浙江、臺灣、江西、廣東、山東等地，其中福建的古田紅曲、烏衣紅曲較為出名。廣西武宣地區(qū)的紅曲米雖歷史悠久，但生產(chǎn)基本上還處于傳統(tǒng)的小規(guī)模作坊式水平。相比于福建紅曲，廣西紅曲米因知名度較小，較少有學者對其進行研究。目前對紅曲的研究主要集中在其代謝產(chǎn)物Monacolin K、洛伐他汀、桔霉素以及產(chǎn)色素和發(fā)酵食品等方面，少有對紅曲風味的研究[9]。頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)是檢測食品風味組分的實用技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的檢測方法，其具有靈敏度高、檢測時間短、樣品用量少的特點[10]。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對廣西武宣地區(qū)8種紅曲米的風味組成進行解析，結(jié)合主成分分析法(PCA)，進一步研究武宣地區(qū)紅曲米的各種揮發(fā)性成分對其整體風味的貢獻程度，為了解廣西紅曲米的風味構(gòu)成、進一步對其品質(zhì)進行探索提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

7890B GC-5977A MSD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-Wax彈性石英毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美國Agilent公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR on PDMS)萃取頭 美國Supelco公司；白米、紅曲米 廣西來賓市武宣縣。

表1 紅曲米的采樣點Table 1 The sampling sites of red yeast rice

1.2 方法

1.2.1 紅曲米制作工藝

由圖1可知，廣西武宣紅曲米以白米為原料，蒸熟米飯后加入用白醋泡發(fā)的干紅曲米米漿，充分拌勻后自然發(fā)酵。發(fā)酵過程的前12 h蓋布保溫，12 h后揭開布繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵24 h時，洗米2次，晾干至不滴水且內(nèi)部發(fā)熱，在發(fā)酵24 h時，再次洗米，晾干后即為紅曲米。

圖1 工藝流程Fig.1 The technological process

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

1.2.2 揮發(fā)性風味組分分析

GC條件：DB-Wax毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為氦氣(He)，流速為20 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度為240 ℃；起始溫度為40 ℃，保持5 min后以2 ℃/min的速度升溫至120 ℃，隨后將升溫速度改為4 ℃/min，當溫度升至240 ℃時保留5 min；后運行溫度設(shè)為240 ℃，后運行時間為5 min。

MS條件：電子電離(electronic ionization，EI)，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，連接桿溫度為150 ℃。采用全掃描模式收集信號，掃描范圍為33～550 m/z。

香氣成分的提?。喝?.5 g待測樣品裝入20 mL的萃取瓶中密封后置于60 ℃水浴鍋中平衡30 min，將老化的萃取頭插入樣品瓶中，頂空萃取30 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析1.2.3.1 定性方法

將檢測得到的物質(zhì)譜圖與標準譜庫NIST 11和Wiley進行比對檢索，結(jié)合保留指數(shù)相關(guān)文獻及書籍資料的查詢，準確鑒定出武宣地區(qū)紅曲米香氣中的各個化學成分。

1.2.3.2 主成分分析

采用R語言軟件，根據(jù)相關(guān)成分的相對含量、特征根以及特征向量，計算各主成分值，并以此做PCA圖和載荷圖[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西武宣地區(qū)紅曲米揮發(fā)性風味物質(zhì)組成分析

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)檢測了白米和廣西武宣地區(qū)8種紅曲米的揮發(fā)性風味組分，由表2可知，BM中共鑒定出68種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類6種、酮類6種、醇類4種、酸類1種、醛類13種、酚類5種、吡嗪類2種、烷烴類7種、醚類4種、其他化合物20種。紅曲米中共鑒定出95種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類18種、酮類17種、醇類14種、酸類12種、醛類4種、酚類8種、吡嗪類6種、烷烴類4種、醚類3種、其他化合物9種。

表2 白米中主要揮發(fā)性物質(zhì)檢出結(jié)果Table 2 The detection results of main volatile substances in white rice

由表3可知，GS1、GS2、GS3、GS4、GS5、SL、HM、HT分別檢出55，46，45，46，61，63，46，47種揮發(fā)性成分，其中，SL檢測出的化合物數(shù)量最多，GS3檢測出的化合物數(shù)量最少。

表3 武宣地區(qū)紅曲米中揮發(fā)性物質(zhì)檢出結(jié)果Table 3 The detection results of volatile substances in red yeast rice in Wuxuan region

本次試驗白米檢出的揮發(fā)性組分中，醛類、其他類、酚類物質(zhì)的占比較高，醛類物質(zhì)的相對含量占比為52.44%，是白米風味物質(zhì)中的主要成分，包含己醛、正辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛等，這些物質(zhì)多具有茉莉、水仙花等令人愉悅的花香。3-糠醛是含量最高的醛類物質(zhì)，其次是5-甲基呋喃醛，分別占總含量的26.58%和12.45%。3-糠醛可以作為香精油、化妝品或藥物的中間體，有杏仁氣味。5-甲基呋喃醛是通用食用香料的一種重要組成，也是2,5-二甲基呋喃的重要中間體，具有芳香的氣味[12]。酚類物質(zhì)是白米風味物質(zhì)中的重要成分，相對含量占比為12.76%，其中2,6-二叔丁基對甲酚在總含量占比達到11.76%，具有烘烤的氣味。張敏等[13]對不同品種稻米的風味進行了研究，發(fā)現(xiàn)醛類在稻米所有風味化合物類別中占比最大，是主要風味物質(zhì)，其檢測出了稻米中含有辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、2-戊基呋喃等，與本研究的檢測結(jié)果相同。

本次試驗紅曲米檢出的揮發(fā)性組分中，酸類、醇類、酮類、酯類物質(zhì)的占比較高。紅曲米中的乳酸菌在發(fā)酵過程中會生成一些有機酸，如乙酸、己酸、戊酸等，其相對含量較高，是廣西武宣地區(qū)紅曲米中重要的呈味物質(zhì)[14]。8種紅曲米中檢出的醇類物質(zhì)多為C6-C8的低碳鏈醇，其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草的香氣，2-庚醇呈檸檬和青草香，苯乙醇具有玫瑰花香，這些醇類物質(zhì)賦予紅曲米醇香、花香的氣味。酮類是大米中非常重要的揮發(fā)性風味組分[15]，其通常來自于發(fā)酵過程中多不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸的降解或微生物的氧化[16]。本次試驗檢出的酮類物質(zhì)中，多具有水果、牛奶和藥草的香氣，如2-庚酮具有干酪、香蕉的香氣，甲基壬基甲酮呈柑橘類、油脂香，香葉基丙酮具有木蘭香氣，略帶玫瑰香。酯類物質(zhì)是酵母或絲狀真菌在發(fā)酵時期的代謝產(chǎn)物，通過脂肪酸酯化得來[17]，如甲酸己酯、醋酸辛酯等酯類化合物，對廣西武宣地區(qū)紅曲米中的果香香氣有貢獻。

進一步對紅曲米中定性的化合物進行對比分析，發(fā)現(xiàn)武宣地區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)生產(chǎn)的紅曲米中揮發(fā)性風味組分存在顯著性差異。由圖2可知，根據(jù)各類揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量占比，對A村地區(qū)紅曲米的香氣貢獻最大的是酸類，其次是醇類和酯類，貢獻最少的是醚類；對B村地區(qū)紅曲米的風味而言，占據(jù)主導位置的物質(zhì)是醇類，其次是酮類；C村和D村生產(chǎn)的紅曲米，風味物質(zhì)的含量大體相同，但C村貢獻最大的物質(zhì)是酮類，而D村是醇類，其次均為吡嗪類。由此可見，廣西武宣地區(qū)紅曲米風味化合物的種類大體相同，但不同村落生產(chǎn)的紅曲米在起關(guān)鍵風味作用的化合物上存在差異。

圖2 武宣地區(qū)不同村落紅曲米中揮發(fā)性物質(zhì)種類分布Fig.2 The distribution of volatile substances in red yeast rice from different villages in Wuxuan region

圖3直觀地表現(xiàn)了8種紅曲米中各種揮發(fā)性組分相對含量的相對豐度。對紅曲米風味物質(zhì)豐度進行標準化層次聚類后得到相對豐度，數(shù)字越大表示相對含量越高[18]。由圖3可知，GS4紅曲米中，特有的揮發(fā)性物質(zhì)是乙酸己酯、3-辛烯-2-酮、2-十四烷醇、對甲基苯甲酸甲酯和丙位辛內(nèi)酯，其中乙酸己酯賦予GS4梨和蘋果的香氣，丙位辛內(nèi)酯為其增添了藥草和椰子的風味。GS2紅曲米含有的甲酸己酯，使其具有蘋果和未成熟梅子的甜香。N-氨基四氫吡咯、α-戊基-γ-丁內(nèi)酯、(±)-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、2-茨酮、癸酸、2-哌嗪酮、丙位庚內(nèi)酯這些化合物只存在于A村所產(chǎn)的紅曲米中，在其他村落所產(chǎn)紅曲米中沒有檢測到。SL紅曲米中，酮類化合物的種類最多，因此其風味中，干酪和油脂的香韻較濃郁。且2,5-二叔丁基酚、棕櫚酸是只存在于SL紅曲米中的揮發(fā)性物質(zhì)。HM和HT紅曲米中，2,6-二甲基吡嗪和2-庚酮的含量較高，可能是這些化合物的協(xié)同作用，導致不同村落所產(chǎn)紅曲米的特征香氣存在差異。A村紅曲米的香氣傾向于果香；B村紅曲米的香氣傾向于脂香和花香；C村和D村紅曲米的香氣傾向于烘焙香型。8種紅曲米中均檢出的揮發(fā)性風味組分為2,6-二甲基吡嗪、十六烷、壬醛、十四烷、乙酸、1-辛烯-3-醇、長葉烯、香葉基丙酮，這些化合物構(gòu)成了紅曲米特有的風味。通過對比分析可以得出，武宣地區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)生產(chǎn)的紅曲米中風味物質(zhì)明顯不同，這可能與紅曲米中微生物種類不同以及地方水質(zhì)有關(guān)。

圖3 武宣地區(qū)紅曲米中揮發(fā)性風味化合物熱圖Fig.3 Heat map of volatile flavor compounds in red yeast rice in Wuxuan region

程偉等[19]利用氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)(GC-MS)測定一株紅曲霉菌種子液的香氣物質(zhì)，研究表明，紅曲霉種子液中主要風味的貢獻者是醇類物質(zhì)。其檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)與本研究一致的有苯乙醇、2-甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯。紅曲米是以白米為原料，由多種紅曲霉菌、乳酸菌、醋酸桿菌等微生物發(fā)酵而成的傳統(tǒng)食品，由近年來學者對普通白米和紅曲霉菌株揮發(fā)性化合物檢測的研究可認為[20-22]，紅曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了帶有花香的醇類物質(zhì)，具有堅果香、烘烤香的吡嗪類物質(zhì)及富含果香的酯類物質(zhì)，這些重要的風味化合物賦予了紅曲米獨特的風味。

2.2 廣西武宣地區(qū)紅曲米揮發(fā)性風味物質(zhì)主成分分析

主成分分析是一種研究多個變量間相關(guān)性的多元統(tǒng)計方法，其原理是將原有變量重新組合，通過較少的幾個主成分盡可能多地反映原有多個變量間的相關(guān)性[23]。本研究利用R語言對白米及8種紅曲米香氣成分的含量進行主成分分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，A村紅曲米和B、C、D村紅曲米處于不同的象限，說明A村紅曲米與其他村落的紅曲米在揮發(fā)性物質(zhì)的組成上有較大差異。其中，A村紅曲米處于圖4(a)的第四象限，主要和第二主成分(PC2)呈負相關(guān)，與其相關(guān)性較大的主成分有乙酸(C27)、壬酸(C77)、2-正戊基呋喃(C4)、異戊酸(C43)和2,6-二甲氧基苯酚(C75)。

(a)

B、C、D 3個村落的紅曲米處于圖4(a)的第一象限，與第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)均呈正相關(guān)關(guān)系。三者彼此間隔距離較小，說明這3種紅曲米中揮發(fā)性物質(zhì)的組成差異較小。與這三者相關(guān)性較大的主成分包括2,6-二甲基吡嗪(C12)、2-庚酮(C2)、十六烷(C19)、壬醛(C22)、正己醇(C16)、α-松油醇(C45)、4-羥基丁酸乙酰酯(C17)。這4個不同村落生產(chǎn)的紅曲米，其揮發(fā)性化合物在種類和含量上存在顯著差異，這可能是由于所用曲種不同，其內(nèi)含的微生物種類和數(shù)量不同，影響紅曲米發(fā)酵過程，導致風味上差異顯著。后續(xù)可以通過對廣西紅曲米中微生物菌群的鑒定，分析其影響紅曲米風味形成過程的機理。同時，篩選出發(fā)酵過程中有益的優(yōu)勢菌株，利用純種混合發(fā)酵，提高廣西紅曲米的發(fā)酵特性及品質(zhì)。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取技術(shù)對廣西武宣地區(qū)不同村落所產(chǎn)8種紅曲米的香氣成分進行提取，并使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進行分析鑒定，結(jié)果表明，8種紅曲米中共鑒定出95種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類18種、酮類17種、醇類14種、酸類12種、醛類4種、酚類8種、吡嗪類6種、烷烴類4種、醚類3種、其他化合物9種。均檢出的揮發(fā)性風味組分是2,6-二甲基吡嗪、十六烷、壬醛、十四烷、乙酸、1-辛烯-3-醇、長葉烯和香葉基丙酮，這些化合物多具有脂香、花香和果香，構(gòu)成了紅曲米獨特的主體香氣特征。

對8種紅曲米的香氣成分進行主成分分析，結(jié)果表明，A村紅曲米與其他村落的紅曲米在揮發(fā)性物質(zhì)的組成上有較大差異，而B、C、D 3個村落的紅曲米中揮發(fā)性物質(zhì)的組成差異較小。乙酸、壬酸、2-正戊基呋喃、異戊酸和2,6-二甲氧基苯酚對A村紅曲米的主體香氣有重要貢獻；2,6-二甲基吡嗪、2-庚酮、十六烷、壬醛、正己醇、α-松油醇、4-羥基丁酸乙酰酯對B、C、D村紅曲米主體香氣的貢獻較顯著。