李 岳 張志強 陳 亞 徐 瑤 王 琳*

(1. 佳木斯大學研究生院，黑龍江 佳木斯154007；2. 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154002)

膠質瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，可致命損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]，通常發(fā)生在顱腦深處，常浸潤到鄰近的正常腦組織，治療起來非常困難[2]。化療多采取全身系統(tǒng)給藥，在抗腫瘤的過程中也會傷害正常組織細胞，甚至出現(xiàn)嚴重的毒副作用，如骨髓抑制、肝腎毒性、過敏反應、脫發(fā)、惡心、嘔吐等[3-5]。單一用藥易使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，因此，臨床上常采用聯(lián)合用藥的方法治療惡性腫瘤[6-8]。尋找安全有效并且耐藥性低的藥物成為現(xiàn)階段腫瘤治療的熱點，同樣，如何低毒、高效的治療腫瘤儼然成為研究的熱點問題。阿霉素在與其他抗腫瘤藥物連用過程中取得不錯的效果；天然有機小分子化合物姜黃素已被證實具有顯著抗腫瘤、抗炎等多種功效[9]，同時，姜黃素中所含有的一種活性成分阿魏酸鈉，具有改善腦微循環(huán)的作用，并且毒副作用極低[10]。

1 實驗材料與儀器

U251細胞(武漢細胞庫)，CCK-8(碧云天生物)，阿霉素(Dox)、姜黃素(Cur,北京索萊寶科技有限公司)，全自動酶標儀(美國Bio-TEK公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，P53(博士德生物公司)。

2 實驗方法

2.1 CCK-8實驗

將處于對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度。于96孔板各孔中加入100微升懸液，接種密度為1.25萬/孔，置于培養(yǎng)箱48 h。阿霉素濃度梯度為1、2、 3、 4 、5 μg/L；姜黃素濃度梯度為0、25、50、75、100、125 μg/L。將兩藥分別加入96孔板，每個濃度設置5個復孔，培養(yǎng)24、48 h。然后在每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀檢測吸光度值。確定最適濃度后，阿霉素和姜黃素按1/4∶1/4、1/2∶1/2、1∶1的濃度比例對細胞重復上述實驗。

2.2 蛋白免疫印跡檢測

提取細胞蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜在5%脫脂奶粉的溶液中封閉1 h，分別與P53(1∶1 000)，β-actin(1∶2 000)，冰箱4 ℃冷藏過夜。洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，37 ℃孵育1 h。最后用全自動化學分析成像系統(tǒng)進行檢測。以β-actin作為蛋白參照，檢測各目的蛋白條帶灰度值，從而確定相應蛋白表達量。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。當P<0.05，數(shù)據(jù)差異才具有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結果

4.1 阿霉素和姜黃素對U251細胞增殖的影響

阿霉素和姜黃素分別作用細胞48 h后，不同濃度的兩種藥物對U251細胞增殖具有明顯的抑制作用，分別如表1和表2所示。隨著藥物濃度的增高，細胞存活率明顯降低。當阿霉素濃度為1 μmol/L；姜黃素濃度為3 μmol/L時，細胞存活率約為50%。

表1 不同濃度阿霉素對U251細胞存活率的影響Tab. 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on the survival rate of U251 cells

表2 不同濃度姜黃素對U251細胞存活率的影響Tab. 2 Effects of different concentrations of curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素聯(lián)合姜黃素對U251細胞增殖的影響

與正常對照組和單獨用藥組相比，兩藥聯(lián)合顯著降低細胞存活率，如表3所示。U251細胞在阿霉素和姜黃素濃度為比例為1∶3時抑制效果最明顯。

表3 DOX聯(lián)合姜黃素對U251細胞存活率的影響Tab. 3 Effect of DOX combined with curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素和姜黃素對U251細胞P53蛋白表達的影響

如圖1示，與對照組相比，阿霉素、姜黃素以及兩藥聯(lián)合均可以提高P53蛋白表達量(p<0.05)，兩藥聯(lián)合治療尤為顯著(p<0.01)。

圖1 不同用藥下P53蛋白表達情況Fig. 1 P53 protein expression under different medications

5 討論

腦膠質瘤屬于人類發(fā)病率最高的顱內(nèi)腫瘤，具有多中心發(fā)生、侵襲生長、富含血管及易轉移等生物學特點[11-12]。目前，腦膠質瘤的典型治療手段是手術為主，輔助放療、化療相結合。阿霉素作為臨床一線化療藥物因其嚴重的心肌毒副作用影響其臨床應用。本文通過中西藥聯(lián)合的方式增加藥物的抗腫瘤的作用，為臨床腫瘤治療的新方案提供依據(jù)，在一定程度上防止腫瘤復發(fā)、轉移。本文實驗結果表明，阿霉素和姜黃素對U251細胞的抑制呈現(xiàn)時間濃度依賴性，而且二者聯(lián)用具有協(xié)同作用，比兩者單獨用藥抑制率更高。