馬榮雪，周永海，程登虎，李世玉，張 顯，李 好，馬建祥，張 勇

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. & Nakai)為葫蘆科西瓜屬植物，其果實汁多味美、營養(yǎng)豐富，富含番茄紅素[1]。番茄紅素是類胡蘿卜素中最有效的抗氧化劑，具有重要的抗病和保健功能[2-3]。研究表明，紅瓤西瓜中的番茄紅素含量比許多鮮食番茄品種高，并且鮮西瓜的番茄紅素與烹飪后番茄汁中的番茄紅素的生物可利用性相同[4]，所以提高西瓜番茄紅素含量具有重要意義。

影響果實番茄紅素含量的因素很多，溫度、水分、土壤等生態(tài)環(huán)境都是重要的影響因子。李莉等[5]研究表明，適當(dāng)加大晝夜溫差有利于番茄果實中番茄紅素的合成。Brandt等[6]發(fā)現(xiàn)，50%最適水分供給量的番茄果實中番茄紅素含量(86.5 mg/kg)高于100%最適水分供給量的果實(62.5 mg/kg)。Dia等[7]發(fā)現(xiàn)，西瓜番茄紅素含量因環(huán)境不同造成的差異比品種之間的差異更顯著。有研究表明，外源物質(zhì)也能影響番茄果實的番茄紅素含量，如Mn2+、K+等陽離子可促進番茄果實中番茄紅素的積累[8]。而外源激素也能調(diào)節(jié)類胡蘿卜素等次生產(chǎn)物的代謝，如脫落酸(ABA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)等均可促進番茄紅素的積累[9-11]，而對番茄果實外源涂抹赤霉素(GA3)則抑制番茄紅素的合成[9]。

番茄紅素的合成過程包括縮合、脫氫、環(huán)化、羥基化及環(huán)氧化等一系列反應(yīng)，其中植物烯合成酶(PSY)催化2分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)合成1分子的八氫番茄紅素，然后通過八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)轉(zhuǎn)化為六氫番茄紅素和ζ-胡蘿卜素。ζ-胡蘿卜素由ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶(Z-ISO)異構(gòu)化并且通過ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)兩次脫氫成為鏈孢紅素和四-順式-番茄紅素，然后在胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)的作用下異構(gòu)化為紅色的全反式番茄紅素。番茄紅素有兩條主要的代謝途徑：一是通過番茄紅素ε-環(huán)化酶(LCYE)和番茄紅素β環(huán)化酶(LCYB)生成α-胡蘿卜素，然后合成葉黃素；二是通過LCYB生成β-胡蘿卜素，進一步通過9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)合成ABA[12-13]。Dou等[14]研究認為，番茄紅素合成途徑上游PSY基因和控制分解的LCYB基因在番茄紅素合成中可能起到較為重要的作用，其中LCYB基因?qū)ξ鞴先可痍P(guān)鍵作用。Haejeen等[15]研究發(fā)現(xiàn),西瓜番茄紅素含量與LCYB基因有關(guān)。

目前有關(guān)外源物質(zhì)對番茄紅素含量及其關(guān)鍵酶基因影響的研究較少，且在西瓜上鮮有報道。為此，本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，選用ABA、MnSO4和褪黑素(MT) 3種外源物質(zhì)，探討其對西瓜番茄紅素含量及合成代謝相關(guān)酶基因表達的影響，為明確番茄紅素積累內(nèi)在機理和提高西瓜番茄紅素含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜品種為紅瓤西瓜玲瓏王，嫁接砧木為南瓜。

所用試劑甲醇、乙腈、MTBE均為色譜級，番茄紅素標準品為Sigma公司產(chǎn)品，EASY多糖多酚RNA提取試劑盒(離心柱型)由北京君諾德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)astKing cDNA First Chain Synthesis Kit試劑盒由TIANGEN 公司生產(chǎn)，iQ5實時定量儀由美國Bio-rad公司生產(chǎn)，SYBR? Premix Ex Taq TM II(2×)試劑盒由日本TaKaRa生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020年3-7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)揉谷鎮(zhèn)西甜瓜試驗站塑料大棚中進行。西瓜種植株行距為80 cm×50 cm，均采用常規(guī)栽培管理方式及水肥供給方法。在植株長到伸蔓期時，按前期篩選到的最佳濃度,葉面分別噴施20 μmol/L ABA、0.002 μmol/L MnSO4和500 μmol/L MT，以噴施清水為對照(CK)，每7 d噴施1次，直至授粉期結(jié)束，共噴施3次。試驗采用隨機區(qū)組排列,每個處理3次重復(fù)，每重復(fù)30株。授粉后10 d開始采樣，每7 d采樣1次，即分別于授粉后10，17，24，31，38 d采樣，共采收5次。每個重復(fù)選取5個長勢一致且發(fā)育良好的果實縱切，在果實中心部位取樣后混合，用錫箔紙包裹后迅速在液氮中冷凍，然后放于超低溫冰箱中儲存，一部分用于番茄紅素測定，一部分用于定量分析。

1.3 方 法

1.3.1 番茄紅素的提取純化 稱取瓜樣2 g，置于冷凍干燥機中干燥，用丙酮-乙醇提取液(體積比1∶1，含0.01%丁羥甲苯(BHT))洗滌至無色，合并洗滌液并定容至10 mL。使用水浴旋轉(zhuǎn)蒸干儀蒸干，用1 mL乙酸乙酯(色譜級)溶解，0.22 μm有機相濾膜過濾后加入進樣瓶中。

1.3.2 番茄紅素含量的測定 番茄紅素的HPLC測定參照劉慶[16]的方法，根據(jù)實際情況稍加改動。色譜柱使用YMC C30類胡蘿卜素專用色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相:A相為V(乙腈)∶V(甲醇)=3∶1(含0.01% BHT和0.05%三乙胺)，B相為100%甲基叔丁基醚(含0.01% BHT)。流速1.00 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長450 nm，進樣量10 μL。洗脫條件為:0 min.V(A)∶V(B)=99∶1;0～10 min.V(A)∶V(B)=85∶15;10～16 min.V(A)∶V(B)=82∶18;16～25 min.V(A)∶V(B)=75∶25；25～54 min.V(A)∶V(B)=50∶50;54～64 min.V(A)∶V(B)=18∶82;65 min.V(A)∶V(B)=99∶1；66 min 停止。出峰時間為45.53 min。

1.3.3 番茄紅素生物合成相關(guān)酶基因的實時熒光定量PCR分析 采用EASY多糖多酚RNA提取試劑盒(離心柱型)提取果肉樣品RNA。采用FastKing cDNA First Chain Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過http://cucurbitgenomics.org/search/genome/4網(wǎng)頁查詢牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(GGPS)、ZDS、PSY、LCYB、LCYE、NCED等番茄紅素代謝酶基因的全長序列，利用Primer3Plus設(shè)計目的基因特異引物(表1)，引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，基因的相對定量分析采用iQ5實時定量儀進行分析，用SYBR? Premix Ex Taq TM Ⅱ(2×)試劑盒擴增PCR產(chǎn)物。

表1 番茄紅素代謝酶基因的RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of real-time PCR primers for genes of lycopene metabolizing enzymes

反應(yīng)體系總計20 μL，分別為SYBR熒光燃料10 μL、cDNA 1 μL、ROX 0.2 μL、ddH2O 7.8 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR擴增條件為：95 ℃滅火活3 min：95 ℃失活30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計40個循環(huán)。以適用于西瓜熒光定量PCR的Actin為內(nèi)參基因，以噴施清水西瓜植株授粉后10 d的果肉cDNA為對照，利用合成的引物，采用2-ΔΔCt法對熒光定量PCR擴增數(shù)據(jù)進行處理，目的基因相對于內(nèi)參基因的相對表達量通過2-ΔΔCt值來確定，每個基因3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel、SPSS軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源物質(zhì)對西瓜番茄紅素積累的影響

2.1.1 對西瓜果肉顏色生長發(fā)育的影響 不同處理果實各個發(fā)育時期的果肉顏色變化如圖1所示。由圖1可以看出，在授粉后10 d，西瓜果肉顏色均為白色；授粉后17 d時，果肉顏色開始顯現(xiàn)紅色，此時3種外源物質(zhì)處理果肉顏色均比清水對照的深；授粉后24～31 d，隨著果實的膨大，西瓜果肉顏色不斷加深，3種外源物質(zhì)處理的西瓜瓤色仍強于對照；授粉后38 d時，果實完全成熟，果肉顏色最紅，處理間果肉顏色相近，從顏色上看，與對照相比無明顯差異。

圖1 不同外源物質(zhì)處理西瓜授粉后果肉顏色隨時間的變化Fig.1 Changes of flesh color in watermelon at different stages after pollination under different exogenous substances treatments

2.1.2 對西瓜果實番茄紅素積累量的影響 如圖2所示，西瓜番茄紅素含量隨著授粉后時間的延長逐步增加。在授粉后10 d，MnSO4處理番茄紅素含量為5.54 μg/g，ABA處理番茄紅素含量為1.58 μg/g，而其他處理則未檢測到番茄紅素。在授粉后17 d，4種處理西瓜果實均可檢測到番茄紅素，MT處理番茄紅素含量(12.85 μg/g)最高， MnSO4處理次之，二者無顯著差異，ABA處理番茄紅素含量顯著低于MnSO4和MT處理，但3種外源物質(zhì)處理番茄紅素含量均顯著高于清水對照，分別較清水對照高2.78，2.46和1.36倍，隨后西瓜果實番茄紅素含量迅速積累。到授粉后31 d時，番茄紅素積累速度開始減慢，授粉后38 d時西瓜完全成熟，番茄紅素含量達到峰值，MnSO4、ABA、MT 3個外源物質(zhì)處理西瓜果實番茄紅素含量分別為90.78，82.24和82.13 μg/g，且均顯著高于清水對照(65.00 μg/g)，但3種外源物質(zhì)處理間番茄紅素含量差異不顯著。

圖柱上標不同小寫字母表示在P<0.05水平上處理間差異顯著Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the P<0.05 level圖2 不同外源物質(zhì)處理西瓜授粉后果肉番茄紅素含量隨時間的變化Fig.2 Changes in lycopene content in watermelon fruits at different stages after pollination under different exogenous substances treatments

2.2 不同外源物質(zhì)處理后西瓜關(guān)鍵酶基因表達量的變化

2.2.1 ABA處理 由圖3可以看出，ABA處理后，西瓜不同授粉時間果實番茄紅素關(guān)鍵酶基因的相對表達量與清水對照處理間存在差異，其中番茄紅素環(huán)化酶基因(LCYB、LCYE)的差異尤為明顯。

*表示在P<0.05水平差異顯著，**表示在P<0.01水平差異極顯著。下同* means significant difference at P<0.05,** means extremely significant difference at P<0.01.The same below圖3 ABA處理西瓜授粉后不同時間果實番茄紅素關(guān)鍵酶基因相對表達量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in expression levels of lycopene key enzyme genes in watermelon fruits after pollination under ABA treatment

與對照相比，番茄紅素合成的主要限制酶基因PSY1的相對表達量在授粉后17，31和38 d時顯著或者極顯著上調(diào)表達，而授粉后10 d顯著下調(diào)表達。與對照相比，LCYB1基因的相對表達量在授粉后17和38 d顯著或極顯著下調(diào)；LCYB2基因的相對表達量在授粉后24，31和38 d顯著或極顯著下調(diào)；LCYE基因的下調(diào)表達主要在授粉后24 d開始出現(xiàn)，在授粉后31 和38 d時相對表達量極顯著下調(diào)。

2.2.2 MnSO4處理 由圖4可以看出，MnSO4處理后，影響西瓜果實番茄紅素含量的主要原因是番茄紅素合成上游基因的上調(diào)表達。與對照相比，GGPS1和GGPS2基因在授粉后17 和38 d時顯著或極顯著上調(diào)表達。與對照相比，PSY1基因的相對表達量在授粉后17，24和38 d時顯著或極顯著上調(diào)表達，PSY2基因表達量在授粉后10，17和38 d時顯著或極顯著上調(diào)表達，PSY1基因的相對表達量在整個生長周期明顯高于PSY2，說明PSY1基因具有主要調(diào)控作用。與對照相比，ZDS基因在授粉后17和38 d時極顯著或顯著上調(diào)表達，而LCYB1基因在授粉17 d后一直下調(diào)表達，說明下游基因也參與一部分調(diào)控。

圖4 MnSO4處理西瓜授粉后不同時間果實番茄紅素關(guān)鍵酶基因相對表達量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes in expression levels of lycopene key enzyme genes in watermelon fruits after pollination under MnSO4 treatment

2.2.3 MT處理 由圖5可以看出，MT處理后西瓜果實番茄紅素關(guān)鍵酶基因的表達差異主要是由NCED和LCYB引起的。在整個發(fā)育周期，NCED1和NCED7基因的相對表達量極顯著低于清水對照，在授粉后31 d時對照NCED1基因相對表達量約為MT處理的195倍；而NCED7基因在授粉后38 d時與對照差異最大，對照相對表達量約為MT處理的5.4倍。LCYB1基因的相對表達量在授粉后17 和31 d時較清水對照顯著下調(diào)表達；LCYB2在授粉24 d后持續(xù)下調(diào)表達，均極顯著低于清水對照。

圖5 MT處理西瓜授粉后不同時間果實番茄紅素關(guān)鍵酶基因相對表達量的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes in expression levels of lycopene key enzyme genes in watermelon fruits after pollination under MT treatment

3 討 論

Mn2+、ABA、MT能增加西瓜果實中番茄紅素的含量。研究表明，對番茄果實單獨噴施MnSO4和ABA，均促進了果實中番茄紅素的積累，其含量較空白對照增加了36.01%和50.36%[8]。孫倩倩[17]采用MT溶液浸泡綠熟期番茄2 h發(fā)現(xiàn)，MT處理番茄果實中番茄紅素含量是對照的5.1倍。本研究結(jié)果表明，3種外源物質(zhì)處理能促進西瓜果實番茄紅素提前合成，其含量在西瓜整個發(fā)育期均顯著高于對照，且在西瓜果實成熟期即授粉后38 d， MnSO4、ABA、MT 3個外源物質(zhì)處理西瓜果實番茄紅素含量分別為90.78，82.24和82.13 μg/g，且均顯著高于清水對照(65.00 μg/g)。

外源ABA可以增加西瓜果實中番茄紅素的積累量。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA處理使西瓜果實番茄紅素環(huán)化酶基因LCYB1、LCYB2和LCYE的相對表達量總體呈下調(diào)趨勢。而番茄紅素環(huán)化酶基因的表達量降低或者受到抑制時，會導(dǎo)致番茄紅素向α、β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化的效率降低[18]，這與本試驗研究結(jié)果一致。Yu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外源施加ABA是通過降低番茄內(nèi)源ABA含量來釋放內(nèi)源乙烯，引起番茄紅素的積累。Diretto等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LCYB基因過表達會引起番茄中β-胡蘿卜素含量增加，從而使內(nèi)源ABA含量增加，導(dǎo)致乙烯釋放量降低。結(jié)合前人的研究結(jié)果認為，外源施加ABA會抑制LCYB基因的表達，導(dǎo)致β-胡蘿卜素含量下降，進而引起內(nèi)源ABA含量下降，乙烯含量增加，從而促進番茄紅素的積累。

GGPP是類胡蘿卜素的合成前體。在西瓜果實發(fā)育過程中，GGPS基因控制異戊烯焦磷酸(IPP)向GGPP轉(zhuǎn)化，其表達量對類胡蘿卜素的合成具有重要的正向調(diào)節(jié)作用[21]。PSY控制GGPP轉(zhuǎn)化為八氫番茄紅素，是控制番茄紅素合成的一個限速酶基因，對番茄紅素的合成至關(guān)重要。研究表明，Mn2+是決定GGPS合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵調(diào)控因子，PSY催化八氫番茄紅素的形成也依賴Mn2+[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源MnSO4處理提高了西瓜果實GGPS、PSY基因的相對表達量，由此認為，MnSO4處理使番茄紅素合成酶相關(guān)基因上調(diào)表達，增加了番茄紅素合成的前體物質(zhì)，從而加快了番茄紅素的合成。

MT能增加番茄果實中番茄紅素含量，并且以乙烯依賴方式來促進番茄果實番茄紅素的合成，也能顯著降低NCED的表達量[23]。本研究結(jié)果表明，外源MT處理顯著降低了西瓜果實NCED1和NCED7基因的相對表達量。NCED是催化植物ABA合成的關(guān)鍵限速酶基因[24]。NCED活性顯著降低會導(dǎo)致番茄成熟過程中正常通道游離ABA的合成前體和代謝物積累部分受阻，從而導(dǎo)致類胡蘿卜素途徑上游化合物番茄紅素和β-胡蘿卜素等積累增加[25]，這可能是MT影響西瓜果實番茄紅素含量的主要原因。

綜上所述，3種外源物質(zhì)均促進了西瓜番茄紅素的積累，但其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制并不相同，且番茄紅素的合成代謝不只受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，LCYB的蛋白豐度與番茄紅素的積累呈負相關(guān)。為了進一步明確這3種外源物質(zhì)對西瓜番茄紅素積累的影響機制，還需要進一步從酶活性、激素調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白水平、基因等方面進行深入探究。

4 結(jié) 論

MnSO4、ABA和MT 3種外源物質(zhì)均增加了西瓜番茄紅素含量，但其在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機制并不相同。ABA主要通過抑制番茄紅素環(huán)化酶基因LCYB1和LCYB2的表達，降低番茄紅素轉(zhuǎn)化速率，增加番茄紅素含量；MnSO4主要通過番茄紅素合成酶基因的上調(diào)表達，增加番茄紅素的合成速率；MT主要通過NCED等基因的大幅下調(diào)表達，抑制ABA等代謝物的積累，從而使類胡蘿卜素途徑產(chǎn)物番茄紅素含量增加。本研究結(jié)果從栽培管理措施方面為提高西瓜番茄紅素含量提供了思路，也為影響西瓜番茄紅素的內(nèi)在機理研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。