許 靜，李 晶，張雨溪

(西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院，陜西 西安710065)

杏樹是一種宜林宜果的果樹，不僅能起到抵御風沙、保護農(nóng)田、改善環(huán)境的生態(tài)作用，其果實還具有很大的經(jīng)濟價值。杏樹在我國主要分布在東北、華北和西北地區(qū)，其中，陜西杏樹栽培面積約有 10.7 萬hm2，是全國第三大產(chǎn)區(qū)[1-3]。

流膠病是杏樹最主要的病害之一，流行范圍廣泛，輕者引起杏減產(chǎn)，重者可造成絕收，導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失[4]。杏樹流膠病可分為生理性流膠和侵染性流膠2種，其中生理性流膠主要由蟲傷、切口等機械性傷口引起，而侵染性流膠則是由輪枝孢菌、葡萄座腔菌等真菌侵染造成[4-6]。流膠主要發(fā)生在杏樹的枝干上，在病害處流出透明的樹膠，與空氣接觸后，樹膠逐漸變成褐色，成為晶瑩柔軟的膠塊，最后變成深褐色硬質(zhì)膠塊。此外，流膠處常呈腫脹狀，病部皮層及木質(zhì)部逐漸褐化腐朽，嚴重時可造成整株樹死亡[5,7]。其果實也會流膠, 多在有蟲傷的傷口處發(fā)生, 樹膠糊在果面上, 導(dǎo)致果實停止生長。該病在春季到秋季均可發(fā)生，每年5月下旬至6月中旬和8月下旬至9月中旬出現(xiàn)發(fā)病高峰[7]。流膠病的防治主要有以下方法：首先是農(nóng)業(yè)防治，包括及時清理果園移走感染源，及時排澇防旱減少發(fā)病條件，合理施肥以改善杏樹長勢，適度修剪以減少傷口和病原侵入口[8-9]。其次是生物防治，楊艷敏[10]和Li等[11]分別篩選出1株對桃樹流膠病有較好防治效果的解淀粉芽孢桿菌；董施源等[12]從健康桃樹葉片中分離篩選到1株枯草芽孢桿菌，其對造成桃流膠病的可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)有較強的拮抗作用。再次，合理應(yīng)用病毒也是潛在的生防手段，Yang等[13]鑒定了一種可感染葡萄座腔菌的正義單鏈RNA病毒。最后是化學防治，將病部流膠和潰爛組織刮除干凈后，用殺菌劑涂抹傷口，也可進行噴灑或灌根處理[7-8]。但目前最有效、最直接和最穩(wěn)定的防治方法還是依賴于殺菌劑的化學防治。

近幾年流膠病在陜西周至杏樹果園廣泛流行，對果農(nóng)造成較大經(jīng)濟損失，但其病因尚不明確。因此，本研究通過對發(fā)病果園內(nèi)杏樹流膠病枝取樣，用組織培養(yǎng)法進行病原菌的分離純化，采用形態(tài)學和ITS序列分析法進行病原菌鑒定，再用菌絲生長速率法測定3種市面常用殺菌劑對該病菌的抑制作用，以期為該病的診斷和田間有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

從陜西周至杏李研究所采集有流膠病癥的杏樹枝條帶回實驗室，自來水沖洗后用體積分數(shù)75%酒精擦拭表面，用滅菌解剖刀切成小塊后置于PDA平板中心，25 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況并及時轉(zhuǎn)接新的PDA平板進行純化，得到分離病原菌的純培養(yǎng)。

1.2 病原菌的致病性測定

取幼嫩健康的杏樹枝條，用體積分數(shù)75%酒精進行表面消毒后，切成9 cm枝條段，用無菌解剖刀小心刮掉表皮，露出木質(zhì)層。用滅菌的直徑9 mm打孔器從培養(yǎng)4 d的PDA平板上取帶有新鮮菌絲的菌餅，有菌絲一面貼緊枝條傷口處，覆蓋吸有無菌水的無菌脫脂棉，用封口膜固定。將接種后的枝條放入裝有100 mL無菌水的組培瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中(溫度25 ℃，光照周期16 h/8 h，相對濕度70%)培養(yǎng)6 d，每天更換培養(yǎng)枝條用水，以無菌的純PDA培養(yǎng)基瓊脂塊接種為對照，定期觀察病癥發(fā)展情況。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察 將分離純化的菌株接種于PDA平板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落顏色、表面紋飾、形態(tài)與質(zhì)地，描述其培養(yǎng)特征。將菌株接種在水瓊脂培養(yǎng)基上，光照條件下培養(yǎng)2周后在顯微鏡(Nikon)下觀察其分生孢子形態(tài)。

1.3.2 ITS序列分析 收集長滿平板的新鮮菌絲，用天根公司植物全基因組抽提試劑盒提取總DNA，然后使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：ITS1 和ITS4各1 μL,2×PCR Mix(天根公司) 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，并將擴增后的ITS片段送至上海生工生物股份有限公司測序。

將獲得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，根據(jù)序列覆蓋率確定該菌所屬種類，然后用MEGA軟件通過鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進化樹。

1.4 病原菌對3種藥劑的敏感性測定

1.4.1 供試藥劑 供試3種藥劑分別為：70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(山東百農(nóng)思達生物科技有限公司),2.6%靚果安水劑(主要成分為生物堿和梔子甙，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司),2%潰腐靈水劑(主要成分為蒼術(shù)素和厚樸酚，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司)。

1.4.2 含藥培養(yǎng)基的制備 配制含藥培養(yǎng)基時，3種藥劑均設(shè)置6個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度有10個平板，3次重復(fù)。其中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑先用無菌水溶解后再按比例加入培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為0.25，0.5，1，2，4，8 μg/mL；2.6%靚果安水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基中倒平板，終質(zhì)量濃度分別為10.835，21.67，43.3，86.7，173.3，520 μg/mL；2%潰腐靈水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為10.45，20.83，41.67，166.67，666.7，20 000 μg/mL。以不加藥的PDA培養(yǎng)基為對照。

1.4.3 敏感性的測定 將分離得到的病原菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，用直徑4 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到含藥和對照平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對照平板基本長滿菌絲，采用十字交叉法測量各平板上的菌落直徑，計算菌絲生長抑制率(抑制率=(對照菌落直徑-含藥菌落直徑)/對照菌落直徑×100%)。用SPSS 23對不同處理的菌落直徑進行差異顯著性分析。將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為以10為底的對數(shù)值(X)，菌絲生長抑制率轉(zhuǎn)換為概率值(Y)，通過Excel軟件對藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值和菌絲生長抑制率概率值進行線性回歸分析，計算各藥劑對病原菌的半最大效應(yīng)濃度(concentration of 50% of maximal effect,EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ的致病性

用實驗室人工接種分離的杏樹流膠病病原菌病原菌(編號為SXZZ)接種健康杏樹枝條3 d后，接種部位呈黑褐色，有少許白色或灰白色菌絲生長；6 d后接種處呈黑色并開始出現(xiàn)流膠癥狀；對照枝條僅傷口處略呈深褐色，無菌絲生長或流膠癥狀(圖1)。用接種后發(fā)病的枝條重新進行病原菌分離純化，得到的病原菌菌落形態(tài)和分生孢子與接種所用的病原菌完全一致，根據(jù)柯赫氏法則，可以確定分離得到的病原菌就是引起杏樹流膠病的病原菌。

A.對照枝條；B.接種SXZZ 3 d后的枝條；C.接種SXZZ 6 d后的枝條A.Control twig;B.Twig inoculated with SXZZ for 3 d; C.Twig inoculated with SXZZ for 6 d圖1 杏樹流膠病病原菌SXZZ的致病性觀察Fig.1 Evaluation of the pathogenicity of the apricot gummosis pathogen SXZZ

2.2 杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ的形態(tài)特性

杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ在PDA平板上菌落為圓形，菌絲為絨毛狀，培養(yǎng)初期菌落呈白色或灰白色(圖2-A)，隨后逐漸變?yōu)榛疑?，至培養(yǎng)后期呈黑色(圖2-B)。在顯微鏡下觀察，菌絲無色有隔(圖2-C)；分生孢子紡錘形，無色，單孢，基部鈍圓，頂部稍尖(圖2-D)。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌相關(guān)文獻，初步鑒定其為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。

A.培養(yǎng)4 d后的菌落形態(tài)；B.培養(yǎng)2周后的菌落形態(tài)；C.菌絲形態(tài)；D.分生孢子形態(tài)A.Colony morphology after 4 days culture;B.Colony morphology after 2 weeks culture; C.Mycelium morphology;D.Conidia morphology

2.3 杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ的ITS序列分析

對杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ的通用引物PCR產(chǎn)物進行測序，將獲得的序列上傳至GenBank(序列登錄號為MW250225)， Blast比對后發(fā)現(xiàn)，其與葡萄座腔菌的同源性高達99%(圖3)。結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果，可以確定陜西周至地區(qū)杏樹流膠病病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類地位為子囊菌門腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。

圖3 杏樹流膠病病原菌分離物SXZZ的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of apricot gummosis pathogen SXZZ

2.4 杏樹流膠病病原菌對3種藥劑的敏感性

甲基硫菌靈、靚果安和潰腐靈為市面常用的防治果樹流膠病的3種藥劑，為探究其能否用于防治由葡萄座腔菌引起的杏樹流膠病，本研究測定了這3種藥劑對杏樹流膠病病原菌的抑制作用，并計算了相應(yīng)EC50值，結(jié)果見表1。由表1可知，與對照組相比，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為1 μg/mL時能顯著抑制杏樹流膠病病原菌菌絲生長，其EC50為2.831 5 μg/mL；而靚果安和潰腐靈分別在質(zhì)量濃度達到86.7和20.83 μg/mL時，才能顯著抑制杏樹流膠病病原菌菌絲的生長，且抑制率較低，二者的EC50非常高。這說明甲基硫菌靈對葡萄座腔菌菌絲生長有較強的抑制作用，但靚果安和潰腐靈的抑制效果較差，即該菌對靚果安和潰腐靈不敏感。

表1 杏樹流膠病病原菌對3種藥劑的敏感性Table 1 Susceptibility of apricot gummosis pathogen to three fungicides

3 討論與結(jié)論

流膠病是杏樹最主要的病害之一，可造成巨大經(jīng)濟損失。本研究采集有流膠病癥的杏樹枝條，分離純化得到分離物的純培養(yǎng)，根據(jù)分離物的致病性，其菌落、菌絲和分生孢子的形態(tài),以及ITS序列分析結(jié)果，認為引起陜西周至地區(qū)杏樹流膠病的病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類地位為子囊菌門腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。這與Li等[14]報道的浙江省杏樹流膠病病原菌一致。

葡萄座腔菌屬真菌分布廣泛、寄主多樣，是農(nóng)林業(yè)上重要的病原菌或內(nèi)生菌，尤其是葡萄座腔菌可在桃、杏、櫻桃、核桃、柳樹、橡樹、桉樹等45個屬的木本植物上引起潰瘍、枯梢、葉斑病、花果腐爛枯萎等病害，造成巨大經(jīng)濟損失[15-18]。目前對于葡萄座腔菌引起的植物病害主要依賴化學防治，即噴灑、涂抹或灌根各種殺菌劑，主要有氟硅唑、撲海因、多菌靈、三唑類殺菌劑和有機氯類殺菌劑等[19-28]。研究表明，甲基硫菌靈在實驗室條件下對葡萄腔座菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)都有很好的抑制效果，在田間試驗中也有較好的防治效果，但其對不同菌株的敏感性有所差異[24-29]。另外，靚果安和潰腐靈也是市面常見的用于防治流膠病的藥劑，也曾被報道可用于防治葡萄座腔菌引起的果樹流膠病[5]。本研究通過測試這3種藥劑對陜西周至地區(qū)杏樹流膠病病原菌的抑制效果發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈對該菌株有較好的抑制作用，因此針對陜西周至地區(qū)杏樹流膠病的防治可采用甲基硫菌靈噴霧或傷口涂抹等處理；靚果安和潰腐靈雖然在高質(zhì)量濃度時對病原菌菌絲生長有一定抑制作用，但結(jié)合EC50值來看，其抑制效果不佳，但這2種藥劑的有效成分均為植物源生物堿，除了對病原菌生長有直接影響外，此類化合物還可促進植物的生理生長[30]，所以不排除靚果安和潰腐靈可以促進杏樹長勢，從而增強其對流膠病抵抗性的可能。在后續(xù)研究中，將進行活體試驗以驗證這一推測。