陽 沐, 吳 莉, 王季石

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué), 貴州 貴陽, 550004; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 腫瘤科, 貴州 貴陽, 550002;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 貴州 貴陽, 550004)

腫瘤作為一種致死率極高的惡性疾病，對人們的健康造成了極大的威脅，當(dāng)前治療腫瘤的醫(yī)療手段主要包含放射治療、化學(xué)藥物治療、手術(shù)治療，但其療效具有一定的局限性，腫瘤仍然存在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的可能性[1]。目前，嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)療法逐漸成為腫瘤免疫治療中最為有效的新型手段[2]。CAR-T細(xì)胞可在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用下表達(dá)出嵌合抗原受體(CAR), 進(jìn)而精準(zhǔn)識別腫瘤抗原，迅速達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[3]。將納米技術(shù)應(yīng)用至CAR-T中，可促進(jìn)患者自身T淋巴細(xì)胞快速實(shí)現(xiàn)基因改造，提高其對癌細(xì)胞的攻擊能力。結(jié)合納米技術(shù)的CAR-T能夠使T淋巴細(xì)胞表達(dá)出特定的CAR結(jié)構(gòu)域，用以實(shí)現(xiàn)對靶抗原與靶細(xì)胞的識別與殺傷[4]。鑒于此，本文將納米技術(shù)與CAR-T腫瘤免疫治療進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，探究納米技術(shù)在CAR-T腫瘤免疫治療中的應(yīng)用發(fā)展及前景。

1 CAR-T腫瘤免疫治療機(jī)制分析

1.1 CAR的組成結(jié)構(gòu)

早在20世紀(jì)90年代, CAR的概念就已被提出，經(jīng)過多年來不斷探索，基于CAR的基因修飾自體T細(xì)胞免疫治療藥品成功在美國批準(zhǔn)上市，為大量復(fù)發(fā)性急性B淋巴細(xì)胞白血病患者提供了較好的臨床療效。位于細(xì)胞表面用作表達(dá)人工合成基因膜蛋白CAR的T淋巴細(xì)胞，即CAR-T細(xì)胞，相關(guān)研究[5]對其結(jié)構(gòu)與應(yīng)用進(jìn)行了探究，成功提出其面臨的挑戰(zhàn)與應(yīng)用前景。在CAR的結(jié)構(gòu)中，主要囊括3個(gè)組成成分，分別為跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號肽區(qū)、細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)。跨膜區(qū)的主要構(gòu)成元素為CD3、CD4、CD28, 其中存在單鏈可變片段與鉸鏈區(qū)，前者作用在于克服主要組織進(jìn)行相容性復(fù)合時(shí)所受到的限制，后者則可對腫瘤相關(guān)抗原的選擇起到有力的促進(jìn)作用。細(xì)胞內(nèi)信號肽區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)的作用最為關(guān)鍵，能夠?qū)Π屑?xì)胞外表上覆蓋的特異性抗原進(jìn)行有效識別。CAR能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原，進(jìn)而形成相應(yīng)的活化信號，最終促進(jìn)CAR-T實(shí)現(xiàn)活化并發(fā)揮其效用。CAR-T完成活化后能夠大量釋放出與CAR相關(guān)的殺傷因子、增殖因子、細(xì)胞因子。

1.2 CAR-T細(xì)胞活化與作用機(jī)制

作為一種新型生物免疫治療方法, CAR-T在血液腫瘤的臨床治療中具有顯著療效，相關(guān)學(xué)者[6]對CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了探究，驗(yàn)證了該種療法的優(yōu)勢。研究人員[7]針對CAR-T在臨床應(yīng)用中暴露出的載體安全性等問題，通過優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)中的胞外抗原結(jié)合區(qū)的方式，加大對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視力度，有效控制毒副作用。要使T細(xì)胞表現(xiàn)出準(zhǔn)確的免疫應(yīng)答，首先需要令其接受活化處理，并轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。在CAR的組成結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)可憑借其效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，來促進(jìn)T細(xì)胞的活化。與T細(xì)胞的活化機(jī)制相似, CAR-T的活化為一種雙信號途徑，即T細(xì)胞受體與CD28可以同時(shí)作用，二者分別與位于抗原提呈細(xì)胞中的抗原肽、共刺激分子等進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而使得T細(xì)胞被成功激活為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。在早期的CAR中，僅存在3對免疫受體酪氨酸活化基序，且共刺激分子第二信號較少，會導(dǎo)致T細(xì)胞在與抗原結(jié)合之后難以持續(xù)進(jìn)行增殖，造成較差的抗腫瘤效果。因此需要在第一代CAR的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進(jìn)行不斷的優(yōu)化處理，五代CAR結(jié)構(gòu)見圖1。

據(jù)圖1可知，向第一代CAR中添加第二信號分子的CD28, 或是添加共刺激分子，可獲取到第二代CAR, 可顯著延長CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間; 在第二代CAR中加入共刺激結(jié)構(gòu)域，則得到第三代CAR, 能夠使白細(xì)胞介素2不足的不利影響降至最低，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與活化; 為了降低毒副作用的影響，需要在第三代CAR的基礎(chǔ)上再次進(jìn)行優(yōu)化，獲取到第四代CAR, 能夠有效抗擊腫瘤細(xì)胞; 第五代CAR, 即通用型CAR, 其結(jié)構(gòu)與第二代CAR較為類似，區(qū)別在于添加了部分共刺激域，能夠?qū)崿F(xiàn)對其他信號通路的激活。針對部分免疫活性極差的患者，第五代CAR能夠促進(jìn)其進(jìn)行自體CAR-T細(xì)胞治療，提高其臨床療效。

2 基于納米技術(shù)的新型腫瘤免疫治療方式

2.1 改進(jìn)ACT的免疫治療

傳統(tǒng)過繼細(xì)胞療法(ACT)需要對相關(guān)免疫細(xì)胞進(jìn)行分離，并對其進(jìn)行離體處理，最后再將其重新輸回至患者體內(nèi)。通過注射納米聚合物或支架的方式，可建構(gòu)一個(gè)定制化、模式化的局部微環(huán)境，進(jìn)而在原位生產(chǎn)相應(yīng)的免疫信號、腫瘤抗原、共定位炎癥因子。由于部分腫瘤微環(huán)境中具有一定的免疫抑制性，因此ACT的療效會受到較大的影響，添加納米聚合物或支架只針對實(shí)體瘤存在效果，無法對血液惡性腫瘤進(jìn)行有效的治療。ACT在腫瘤治療過程中存在一定的局限性，有學(xué)者[8]針對該問題進(jìn)行了細(xì)致的探討，并分析了CAR-T細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用效果與弊端，旨在提升其臨床療效。鑒于此，納米技術(shù)的重要性愈加凸顯，利用納米技術(shù)能夠在不植入ACT支架的條件下，完成對血液T細(xì)胞的調(diào)節(jié)，該種方式即改進(jìn)ACT療法。改進(jìn)ACT主要包含4個(gè)步驟，其一為對藥物、配體-抗體片段、單克隆抗體等進(jìn)行打包處理，并將其附著于納米顆粒上; 其二為將相應(yīng)的納米顆粒與T細(xì)胞表面進(jìn)行連接; 其三為持續(xù)性提供類自分泌刺激信號給相關(guān)細(xì)胞，旨在最大化地防止轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的功能與活力降低; 其四為通過引發(fā)全身免疫調(diào)節(jié)的形式，來殺傷或消除位于遠(yuǎn)端的腫瘤細(xì)胞，并提高改進(jìn)ACT的抗淋巴瘤效果。

2.2 遞送酶免疫治療

當(dāng)前用作患者體內(nèi)酶遞送的載體主要為4種類型，即細(xì)胞因子、抗原、寡核苷酸、遞送小分子。除此以外，納米顆粒也可應(yīng)用于酶的遞送中。鑒于腫瘤免疫治療藥物在患者體內(nèi)進(jìn)行遞送時(shí)受到一定因素的限制，部分學(xué)者將腫瘤組織及其細(xì)胞的微環(huán)境特征作為研究基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了融合納米技術(shù)的微環(huán)境遞送系統(tǒng)，成功提高了抗腫瘤藥物的遞送效率與臨床療效[9]。在術(shù)后感染期間存在一道防線，即中性粒細(xì)胞，保證該細(xì)胞的活性可有效規(guī)避術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)。中性粒細(xì)胞胞外陷阱作為一種特殊的脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)構(gòu)，能夠在血管內(nèi)形成的過程中對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行隱蔽處理，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤迅速發(fā)生轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致惡性腫瘤或癌癥的發(fā)生。對該胞外陷阱進(jìn)行有力的控制極為必要，因此利用包載中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的納米顆粒完成酶的遞送，能夠?qū)Π庀葳鍖?shí)現(xiàn)有效的催化降解，從根本上抑制腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等其他惡化現(xiàn)象。

2.3 癌癥聯(lián)合免疫治療

治療癌癥的主要手段在殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的過程中，往往會對人體正常細(xì)胞造成一定的損害，更有甚者會導(dǎo)致殘留的惡性腫瘤細(xì)胞經(jīng)由傷患處流入血液循環(huán)中，最終使得患者的預(yù)后較差。除此以外，單一免疫治療模式在治療實(shí)體瘤時(shí)，其療效具有一定的局限性?；诖?，采用納米顆粒來進(jìn)行癌癥聯(lián)合免疫治療，有助于實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效。納米顆粒中囊括的免疫調(diào)節(jié)劑可最大化降低患者全身毒性，促進(jìn)免疫刺激分子產(chǎn)生作用，且促進(jìn)全身免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，最終達(dá)到防止惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與癌癥復(fù)發(fā)的目的。結(jié)合納米技術(shù)的癌癥聯(lián)合免疫治療，對抗癌效果的提升有著顯著的促進(jìn)作用。傳統(tǒng)放療產(chǎn)生的促炎性因子會加速免疫細(xì)胞對抗原的吞噬與呈遞，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)與抗腫瘤免疫應(yīng)答。納米顆?？晌较嚓P(guān)的特異性抗原，隨后被人體內(nèi)的吞噬細(xì)胞進(jìn)行特異性識別與捕獲，增強(qiáng)對惡性腫瘤細(xì)胞的免疫治療效果。

在體內(nèi)研究中，對患黑色素瘤的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先對受試小鼠的原發(fā)病灶進(jìn)行放療處理，再向其注射吸附著抗原的納米顆粒。經(jīng)過一段時(shí)間的恢復(fù)后，該批小鼠的臨床療效顯著增強(qiáng)，且其生存期大大延長。90 d后對該批小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其并不會重新生長出新的腫瘤，這表明應(yīng)用納米技術(shù)進(jìn)行治療能夠?qū)Ψ乐鼓[瘤的復(fù)發(fā)起到關(guān)鍵性的作用。

3 納米技術(shù)在CAR-T腫瘤免疫治療中的臨床應(yīng)用

3.1 納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T在惡性淋巴瘤和血液腫瘤中的應(yīng)用

科研人員[10]認(rèn)為在免疫治療的基礎(chǔ)上融入納米技術(shù)，可有效避免抗原等物質(zhì)出現(xiàn)降解，能顯著提高位于惡性腫瘤部位中的免疫刺激分子的富集度，實(shí)現(xiàn)預(yù)防全身免疫毒性的目的。聯(lián)合納米技術(shù)的CAR-T細(xì)胞可構(gòu)建一個(gè)慢病毒表達(dá)載體，并完成一個(gè)完整的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增體系的培養(yǎng)。臨床研究[11-12]表明，納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T能夠針對復(fù)發(fā)性極強(qiáng)的小兒急性淋巴細(xì)胞白血病起到較好的緩解與治療效果。B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤作為一種罕見的惡性腫瘤疾病，其致死率極高，化療手段可對其實(shí)現(xiàn)一定的病情控制。然而該種方式無法對其他惡性腫瘤疾病取得較好的療效，如轉(zhuǎn)化型淋巴瘤、雙重打擊淋巴瘤等，若患者具有較高的早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，化療也無法起到顯著的控制作用[13-14]。聯(lián)合納米技術(shù)的CAR-T可對預(yù)后較差的B細(xì)胞惡性腫瘤患者進(jìn)行有效的治療，通過CAR-T細(xì)胞重定向免疫的治療手段，在臨床實(shí)驗(yàn)中取得較好的效果。26例接受納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療的B細(xì)胞惡性腫瘤患者，在完成階段性的治療后均獲得了較好的療效，提示該實(shí)驗(yàn)提出的治療手段可行，但在進(jìn)行治療前充足的準(zhǔn)備、治療過程中積極的護(hù)理配合、治療后相關(guān)并發(fā)癥的處理等均會對B細(xì)胞惡性腫瘤患者的康復(fù)造成一定的影響[15]。

白血病作為一種骨髓造血干細(xì)胞惡性克隆性增殖的造血系統(tǒng)腫瘤性疾病，具有較高的致死率，這是由于在該種疾病的治療過程中，化療耐藥與復(fù)發(fā)的現(xiàn)象頻發(fā)。大多數(shù)應(yīng)用于化療的藥物均會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一定的不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的組織急性壞死等癥狀，故而進(jìn)一步加大化療力度，無法促進(jìn)患者康復(fù)[16-17]。納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療的方式，可極大地改善該種現(xiàn)象，可在治療過程中精確地篩選出最佳靶抗原，顯著降低CAR-T細(xì)胞的耐藥性，進(jìn)而令白血病患者的緩解率得到大幅提高，實(shí)現(xiàn)對治療后各類不良反應(yīng)的有效控制[18]。針對急性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)行治療時(shí)，摒棄傳統(tǒng)的化療方式，選擇納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療，可從根本上解決耐藥患者體內(nèi)存在過大腫瘤負(fù)荷的問題，令患者的病情得到明顯的緩解，并改善其預(yù)后療效[19]。納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T在白血病的治療中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T在其他惡性腫瘤中的應(yīng)用

據(jù)前述內(nèi)容可知，在納米技術(shù)的作用下, CAR-T細(xì)胞可發(fā)揮出較強(qiáng)的特異性與個(gè)體性，能夠針對性地治療淋巴瘤與白血病。不僅如此，在其他惡性腫瘤疾病中，該種治療手段也可作為臨床治療的有效策略，如卵巢癌[20]。相關(guān)研究[20]表明，對人體外周血中的單核細(xì)胞進(jìn)行感染處理，進(jìn)而可制備出具有穩(wěn)定表達(dá)的CAR-T細(xì)胞，結(jié)合納米技術(shù)應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法或免疫組織化學(xué)法，可對卵巢癌患者的腫瘤樣本進(jìn)行檢測，還能評估納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T對卵巢癌細(xì)胞的殺傷能力與清除能力。納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療能夠針對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行特異性的識別與殺滅，從根本上防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，避免腫瘤持續(xù)性生長。在實(shí)體瘤治療過程中, CAR-T細(xì)胞療法并未被納入臨床實(shí)驗(yàn)中，然而該種療法已在相關(guān)動物模型實(shí)驗(yàn)中取得了一定的進(jìn)展。相關(guān)學(xué)者[21]應(yīng)用納米技術(shù)將溶瘤病毒與CAR-T細(xì)胞進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，對小鼠異種膠質(zhì)瘤腫瘤模型進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，大幅提升了其抗腫瘤效果與生存率，并突破了CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中的單一性限制。據(jù)受試小鼠體內(nèi)腫瘤生長指標(biāo)顯示，納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T能夠促進(jìn)其產(chǎn)生大量的自然殺傷受體，進(jìn)而加速各類細(xì)胞因子的分泌，最終使得惡性腫瘤細(xì)胞得到完全溶解。臨床實(shí)驗(yàn)[22]表明，除卵巢癌以外，肝癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤疾病，均可在納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療的作用下，得到有效的控制，該方式的抗腫瘤效果極為顯著。

4 結(jié)論與展望

諸多臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, CAR-T細(xì)胞免疫治療可對血液系統(tǒng)中的惡性腫瘤取得較好的療效，但該種治療手段對實(shí)體瘤進(jìn)行治療時(shí)，其療效仍然受到了一定的限制。在整個(gè)治療過程中，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、惡性腫瘤抗原逃逸、治療后的各類不良反應(yīng)，均會對CAR-T細(xì)胞免疫治療的療效造成影響。鑒于此，提高CAR-T細(xì)胞的靶向性與抗腫瘤效果，是腫瘤免疫治療的核心，且從根本上提高CAR-T細(xì)胞的多功能性與特異性識別能力，可顯著改善患者預(yù)后。

納米技術(shù)在CAR-T腫瘤免疫治療中具有較好的應(yīng)用進(jìn)展與廣闊的應(yīng)用前景，在未來的研究中，將深入探討基因工程改造時(shí)利用納米技術(shù)聯(lián)合CAR-T細(xì)胞免疫治療的合理性與安全性。由于3D打印再生技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用愈加廣泛，因此利用相應(yīng)的納米器件可為腫瘤免疫治療提供一定的輔助力量。聯(lián)合納米技術(shù)的腫瘤免疫工程，可促進(jìn)特定細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞及其基質(zhì)的定位準(zhǔn)確度的提升，進(jìn)而使相應(yīng)的納米支架或納米載體應(yīng)用至人體各級淋巴結(jié)構(gòu)中。