姜秀春, 王德軍, 于 賀

(遼寧省盤錦遼油寶石花醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 遼寧 盤錦, 124010)

肺上皮細(xì)胞是維持肺結(jié)構(gòu)完整性以及正常肺功能的重要細(xì)胞[1-2]。木犀草素(Lut)可抑制下咽癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡[3-5]。Hippo/Yes相關(guān)蛋白(YAP)通路已被證明與結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6]; 該通路與主動脈瘤、組織纖維化、病毒性肝炎等人類疾病密切相關(guān)，通過低表達(dá)大腫瘤抑制基因2抑制Hippo信號通路，能改善急性呼吸窘迫綜合征的肺水腫現(xiàn)象，調(diào)控肺內(nèi)炎癥反應(yīng)[7]; YAP作為樞紐可通過調(diào)控Hippo通路抑制肝癌細(xì)胞增殖[8]。其中, 哺乳動物STE20樣蛋白激酶1(MST1)和大腫瘤抑制基因(LAST1)為Hippo信號通路的上游效應(yīng)蛋白，二者被磷酸化后可作用于YAP，且在正常情況下, YAP在細(xì)胞質(zhì)中可參與正常組織的調(diào)節(jié)及代謝，維持細(xì)胞的正常狀態(tài)。目前, Lut對博來霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞Hippo/YAP通路及增殖凋亡的影響，尚未有報道。本研究將不同濃度的Lut應(yīng)用于BLM體外誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞后，檢測其增殖及凋亡情況，并分析Hippo/YAP通路上MST1、LAST1和YAP的磷酸化水平，初步探討其分子機(jī)制，為臨床治療肺損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株: 人肺正常上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞，目錄號: SCSP-5067), 由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會細(xì)胞庫提供。

1.1.2 主要試劑及儀器: 胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基均購自美國Giboc公司; 四甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司; Lut 20 mg/支(純度98%)購自上海源葉生物科技有限公司; 蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司; 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物技術(shù)有限公司; 96孔培養(yǎng)板和CKK-8試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司; MST1、LAST1、YAP、p-MST1、p-LAST1、p-YAP兔單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司; 酶標(biāo)儀Fax-20100購自美國INStat公司; 蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Red公司; CKX41倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 將BEAS-2B細(xì)胞接種至含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度大于80%時，用含0.25% EDTA-Na2的胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 篩選BLM的誘導(dǎo)濃度: 將對數(shù)期的BEAS-2B細(xì)胞使用含0.25% EDTA-Na2的胰蛋白酶消化，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL, 每孔各取200 μL接種至96孔板后持續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞鋪滿孔底。使用適量磷酸緩沖液(PBS)溶解BLM，設(shè)置對照組(不含BLM)以及4、8、12、24 μg/mL BLM誘導(dǎo)12、24、48 h后的實驗組，各實驗組中分別加入含4、8、12、24 μg/mL BLM且用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng); 對照組細(xì)胞僅在培養(yǎng)基中添加溶劑。每組設(shè)置6個復(fù)孔，每孔各加入MTT溶液20 μL, 繼續(xù)孵育4 h后，吸取各孔細(xì)胞上清液，加入150 μL的DMSO, 充分震蕩混勻，反應(yīng)15 min并用全自動酶標(biāo)儀檢測各孔在570 nm處的吸光度(OD值)，然后計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD570 nm-空白組OD570 nm)/(對照組OD570 nm-空白組OD570 nm)×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理方法: 以0.05% DMSO為溶劑，將Lut粉末溶解，配制Lut溶液，選取 BLM 8 μg/mL作用24 h為誘導(dǎo)的濃度和時間。將BEAS-2B細(xì)胞分為BLM組(加入終濃度為8 μg/mL的BLM)、Lut低、中、高濃度組(根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]及前期預(yù)實驗分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為60、80、100 μmol/L的Lut和8 μg/mL的BLM混合溶液)、對照組(僅在培養(yǎng)基中添加等量溶劑)。各組均使用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，檢測各項指標(biāo)。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài): 收集上述1.2.3中分組并培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基, PBS清洗3次后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力: 收集細(xì)胞接種至96孔板(1.0×105個/孔)中，使用不同濃度Lut(60、80、100 μmol/L)和8 μg/mL BLM分別處理24 h后加入10 μL CKK-8試劑于每個孔中，然后孵育2 h, 采用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔細(xì)胞的OD值, OD值越大表示細(xì)胞增殖能力越強。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率: 收集上述1.2.3中分組并培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FragELTMDNA Fragmentation Detection Kit)說明書嚴(yán)格操作，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，每組設(shè)置6個重復(fù)。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)方法檢測BEAS-2B細(xì)胞MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平: 收集上述1.2.3中分組并培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，然后進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體封閉、1∶1 000濃度稀釋后的MST1、LAST1、YAP、p-MST1、p-LAST1、p-YAP和1∶20 00濃度稀釋后的β-actin一抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的IgG二抗中室溫孵育2 h, 用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BLM誘導(dǎo)對BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響

隨著BLM誘導(dǎo)濃度的升高以及誘導(dǎo)時間的延長, BEAS-2B細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)。BLM誘導(dǎo)24 h BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為8 μg/mL, 所以后續(xù)將選取8 μg/mL BLM作用24 h為BLM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞的濃度和時間。見表1。

表1 各濃度BLM誘導(dǎo)不同時間后BEAS-2B細(xì)胞存活率比較

2.2 Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞增殖能力的影響

觀察細(xì)胞形態(tài)后發(fā)現(xiàn): 對照組細(xì)胞形態(tài)正常，大小均勻，排列緊密且呈三角形鵝卵石樣，可見胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)均勻透亮; BLM組細(xì)胞較小，細(xì)胞呈梭形、紡錘形，邊緣不規(guī)則，細(xì)胞間隙增加; Lut低、中、高濃度組細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常。見圖1。與對照組OD值(1.00±0.00)相比, BLM組BEAS-2B細(xì)胞增殖能力OD值(0.34±0.05)顯著降低(P<0.05); 與BLM組相比, Lut低、中、高濃度組BEAS-2B細(xì)胞增殖能力OD值(0.59±0.06)、(0.72±0.09)、(0.86±0.09)逐漸升高(均P<0.05)。

2.3 Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡的影響

與對照組(3.05±0.41)%相比, BLM組BEAS-2B細(xì)胞凋亡率(39.79±4.59)%顯著升高(P<0.05); 與BLM組相比, Lut低、中、高濃度組BEAS-2B細(xì)胞凋亡率(21.51±2.36)%、(15.76±1.73)%、(8.30±0.94)%依次降低(均P<0.05)。見圖2。

2.4 Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞Hippo/YAP通路影響

與對照組相比, BLM組BEAS-2B細(xì)胞MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05); 與BLM組相比, Lut低、中、高濃度組BEAS-2B細(xì)胞MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平依次升高(P<0.05)。見表2、圖3。

A: 對照組; B: BLM組; C: Lut低濃度組; D: Lut中濃度組; E: Lut高濃度組。圖1 Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)的影響(放大倍數(shù)100倍)

表2 各組BEAS-2B細(xì)胞MST1、LAST1和YAP磷酸化水平比較

A: 對照組; B: BLM組; C: Lut低濃度組; D: Lut中濃度組; E: Lut高濃度組。圖3 Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞MST1、LAST1和YAP磷酸化水平的影響

3 討 論

大多數(shù)肺部疾病最終會導(dǎo)致肺換氣功能障礙、呼吸衰竭，其病情進(jìn)展快，病死率高，但目前對肺部疾病的治療手段有限且療效不佳，多數(shù)肺部疾病均可引起肺上皮細(xì)胞損傷[10-11], 因此，研究如何改善肺上皮細(xì)胞損傷對于肺部疾病的治療至關(guān)重要。BLM能夠引起肺毒性、肺上皮細(xì)胞損傷、肺炎和肺纖維化等多種肺部疾病[12], 所以，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上使用不同濃度BLM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)隨著BLM濃度的升高以及誘導(dǎo)時間的延長, BEAS-2B細(xì)胞的存活率顯著降低，且其誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞的IC50約為8 μg/mL, 所以后續(xù)選取8 μg/mL BLM誘導(dǎo)細(xì)胞24 h構(gòu)建體外細(xì)胞模型。

中醫(yī)藥治療肺部疾病的歷史源遠(yuǎn)流長，其中, Lut是一種存在于金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草等傳統(tǒng)中藥中的重要黃酮類化合物，具有抗炎、降糖、抗氧化、抗腫瘤等多種作用，目前在臨床上常用于止咳、祛痰、降尿酸等，同時可用于治療心血管疾病[13]。研究[14-16]發(fā)現(xiàn), Lut能夠抑制三陰性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡。Lut具有調(diào)節(jié)肺上皮離子轉(zhuǎn)運的作用，主要通過提高急性肺損傷中上皮鈉通道蛋白表達(dá)來實現(xiàn)[17], 治療由膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[18]。但是，關(guān)于Lut對BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制的報道較少。本研究使用Lut作用于BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其可使形態(tài)異常的BEAS-2B細(xì)胞趨向正常，并顯著提高細(xì)胞增殖能力，降低細(xì)胞凋亡率，提示Lut具有促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Hippo通路是控制組織器官大小、平衡調(diào)控器官體積、調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸抑制的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而YAP信號通路已經(jīng)被證明與肝癌的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[19]。其中YAP是Hippo途徑的重要影響因子，其活性對于器官生長、細(xì)胞增殖、組織更新與再生至關(guān)重要，且能夠調(diào)控組織病變進(jìn)程[20]。MST1和LAST1為Hippo/YAP通路的主要效應(yīng)因子，其磷酸化蛋白可對YAP起作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的生長和代謝功能[21]。俞曉軍[22]研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾可能抑制Hippo/YAP信號通路，進(jìn)而抑制肺動脈硬化體外模型中肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示, Lut作用于BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞后, Hippo通路下游MST1、LAST1和YAP磷酸化水平顯著提高，提示Lut可能通過促進(jìn)MST1、LAST1和YAP磷酸化水平，激活Hippo/YAP信號通路，從而提高BEAS-2B細(xì)胞增殖能力，抑制其凋亡，與上述俞曉軍[22]研究結(jié)果一致。研究[23]發(fā)現(xiàn), Lut可顯著下調(diào)Hippo通路下游LATS1和YAP磷酸化水平，減少YAP核定位，進(jìn)而改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高血壓，但與本研究結(jié)果并不一致，可能是由于Lut在不同的組織和細(xì)胞中，對Hippo/YAP信號通路所發(fā)揮的作用不盡相同，進(jìn)一步說明Lut對Hippo/YAP信號通路具有調(diào)控作用。

綜上所述, Lut可能通過激活Hippo/YAP信號通路，緩解BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞增殖能力，抑制凋亡。本研究為Lut治療肺部疾病的相關(guān)機(jī)制研究提供了一定的參考。然而, BLM誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷的相關(guān)分子機(jī)制十分復(fù)雜，尚需后續(xù)深入研究。