胡志高, 歐陽艷紅

(海南省人民醫(yī)院 急診科, 海南 ?？? 570000)

保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血損傷是治療急性心肌梗死(AMI)的重要策略[1], 隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展, AMI的靶向治療已成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，相比于心絞痛患者, AMI患者血漿中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜存在顯著差異，以PAX8反義RNA 1(PAX8-AS1)等表達(dá)較為突出。還有研究[4]表明PAX8-AS1-N(PAX8-AS1的一種轉(zhuǎn)錄本)可通過與miR-17-5p相結(jié)合，上調(diào)miR-17-5p相關(guān)靶基因，降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡?；诖?，本研究推測PAX8-AS1可能對AMI的心肌細(xì)胞凋亡起到一定調(diào)控作用，參與AMI的發(fā)生發(fā)展。然而，現(xiàn)階段有關(guān)PAX8-AS1在AMI進(jìn)展中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究檢測了AMI小鼠PAX8-AS1的表達(dá)水平，利用體內(nèi)敲減實驗探究PAX8-AS1對AMI小鼠心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 實驗動物: SPF級雄性C57BL/6J小鼠130只, 20～25 g, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號: No. 11400700309252: 飼養(yǎng)條件: 標(biāo)準(zhǔn)飼料及環(huán)境進(jìn)行喂養(yǎng)(晝夜周期交替)，保持通風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本試驗遵循本院實驗動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)實施，且受其監(jiān)督。

1.1.2 試劑及器材: Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)購于美國Media Cybernetics公司; 光學(xué)顯微鏡購于北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司; 紅四氮唑(TTC)染色試劑盒購于上海BestBio貝博生物公司; 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP鎳端標(biāo)記(TUNEL)凋亡試劑盒購于南京凱基公司; 激光掃描共焦顯微鏡購于日本OLYMPUS 公司; 裂解的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)x蛋白(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)相關(guān)抗體均購于Proteintech公司: BCA試劑盒購于Abcam公司; RNA提取試劑盒購于美國英杰生命技術(shù)有限公司; PrimeScript RT試劑盒購于杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司; SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購于北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司; PAX8-AS1、U6引物由Takara公司設(shè)計; 蛋白提取試劑盒均于自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 模型構(gòu)建

AMI模型構(gòu)建，參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]并進(jìn)行細(xì)微調(diào)整: 用1%戊巴比妥鈉 50 mg/kg腹腔麻醉小鼠，固定后進(jìn)行局部備皮消毒，氣管插管，再與小動物呼吸機(jī)連接，呼吸穩(wěn)定后，打開胸腔，使心臟暴露，以左心耳下緣水平線位置作為標(biāo)志，在線下緣2 mm位置用8-0 Prolene縫線從右向左對小鼠冠狀動脈前降支進(jìn)行緩慢結(jié)扎，結(jié)扎后顯示左心室前壁顏色由鮮紅變成暗紫直至蒼白，心電圖ST段抬高，表明左冠狀動脈前降支結(jié)扎及模型構(gòu)建成功，然后對胸部皮下組織及皮膚逐層縫合，待小鼠恢復(fù)自主呼吸后，將呼吸機(jī)撤除，將氣管插管拔出。

1.3 動物分組及觀察指標(biāo)

1.3.1 觀察小鼠AMI術(shù)后不同時間點(diǎn)心肌組織中PAX8-AS1的表達(dá)變化：取雄性C57BL/6J小鼠64只，在其中隨機(jī)選擇48只小鼠，采取與AMI小鼠相同的手術(shù)方式，但不進(jìn)行左冠狀動脈前降支結(jié)扎，于術(shù)后0、1、2、3、4、5 d各處死8只小鼠，并通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試驗檢測小鼠AMI心肌組織PAX8-AS1表達(dá)情況，作為Sham組。取AMI模型構(gòu)建成功的雄性C57BL/6J小鼠64只，隨機(jī)選擇48只小鼠，于術(shù)后0、1、2、3、4、5 d各處死8只小鼠，并通過RT-qPCR試驗檢測小鼠AMI心肌組織PAX8-AS1表達(dá)情況，作為AMI組。

1.3.2 觀察PAX8-AS1對AMI小鼠心肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用: Sham組中剩余的16只小鼠隨機(jī)分為Sham+Ad-shCon組(8只, Sham術(shù)前7 d于小鼠心肌內(nèi)多點(diǎn)注射100 μL[10]的PAX8-AS1的陰性對照載體shCon)、Sham+Ad-shPAX8-AS1組(8只, Sham術(shù)前7 d于小鼠心肌內(nèi)注射100 μL腺病毒載體shPAX8-AS1); AMI組中剩余的16只小鼠隨機(jī)分為AMI+Ad-shCon組(8只, AMI術(shù)前7 d于小鼠心肌內(nèi)注射100 μL PAX8-AS1的陰性對照載體shCon)、AMI+Ad-shPAX8-AS1組(8只, AMI術(shù)前7 d于小鼠心肌內(nèi)注射100 μL腺病毒載體shPAX8-AS1)。術(shù)后3 d給予過量戊巴比妥鈉處死小鼠，摘取心臟，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定，用于紅四氮唑(TTC)染色、TUNEL染色; 一部分保存于-80 ℃條件下，用于相關(guān)mRNA、蛋白的檢測。

1.3.3 TTC染色: 取出在4%多聚甲醛中固定的各組心臟左心室標(biāo)本，平行于房室溝，沿心底向心尖切成5片，通過TTC染色法測定危險區(qū)域(AAR)和梗死面積(IS), 用濾紙將心臟切片周圍的伊文氏藍(lán)液體吸除干凈。將心臟切片置于37 ℃的含有1% TTC磷酸鹽緩沖液中，避光孵育0.5 h, 再平鋪于載玻片上，軋平，在4%多聚甲醛固定48 h, 將染好的切片按照順序防置，用Image-Pro Plus 6.0對切片進(jìn)行拍照, ARR為白加紅色區(qū)域, IS為白色區(qū)域，計算小鼠IS/ARR。

1.3.4 TUNEL染色: 取于4%多聚甲醛中固定的心肌組織，參照TUNEL凋亡試劑盒說明書操作步驟，檢測心肌組織中的凋亡心肌細(xì)胞，于激光掃描共焦顯微鏡下觀察，心肌凋亡細(xì)胞呈熒光綠。對每張切片隨機(jī)選擇3個視野，計算心肌細(xì)胞的調(diào)亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=心肌細(xì)胞凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測: ① 提取組織中總RNA。其中PAX8-AS1以U6為內(nèi)參。對RNA濃度、純度定量，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。行RT-PCR操作，反應(yīng)體系為50 μL。PAX8-AS1反應(yīng)條件設(shè)定為: 預(yù)變性94 ℃ 10 min, 變性95 ℃ 15 s, 退火60 ℃ 60 s, 延伸72 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計算PAX8-AS1的相對轉(zhuǎn)錄水平。② 引物序列。PAX8-AS1正向引物: 5′-AGACGGTCCAGATTCCAC-3′, 反向引物: 5′-AAGCCACATTCACAGAGGG-3′; U6正向引物: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向引物: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 免疫組化: 取于4%多聚甲醛中固定的心肌組織，常規(guī)石蠟包埋切片，于60 ℃溫箱放置1 h, 脫蠟脫水，在3%雙氧水中37 ℃孵育30 min, 磷酸鹽緩沖液沖洗，于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中放置20 min(95 ℃)，冷卻至室溫，沖洗，封閉, 37 ℃ 10 min。添加一抗，包括Bax(濃度1∶200)、Bcl-2(濃度1∶250)及cleaved-caspase3(濃度1∶200), 4 ℃過夜，沖洗。滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育30 min, 顯色復(fù)染及封片。計算陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%, 陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)[6]為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測: 對各組織中總蛋白進(jìn)行提取和定量，在實施聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離后，予以聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)膜，封閉1 h, 孵育一抗 (均1∶1 000稀釋)，包括Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3和GAPDH, 4 ℃孵育過夜。漂洗一抗后加0.2 μg/mL山羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜、顯影成像。以GAPDH作為內(nèi)參，經(jīng)Image J軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。蛋白表達(dá)水平以灰度值/GAPDH條帶灰度值來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 AMI組和Sham組小鼠術(shù)后心肌組織中PAX8-AS1的變化情況

AMI組小鼠中, PAX8-AS1表達(dá)水平隨著AMI術(shù)后時間的延長而增加，在術(shù)后第3天其PAX8-AS1表達(dá)水平達(dá)到最高值，并高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 隨后PAX8-AS1表達(dá)水平不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Sham組小鼠術(shù)后PAX8-AS1水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。見圖1。

與Sham組比較, ?P<0.05。圖1 小鼠術(shù)后0～5 d心肌組織中PAX8-AS1的變化情況

2.2 各組小鼠心肌組織PAX8-AS1表達(dá)的比較

與Sham+Ad-shCon組PAX8-AS1表達(dá)(1.02±0.02)比較, Sham+Ad-shPAX8-AS1組(0.67±0.04)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); AMI+Ad-shCon組(1.69±0.14)及AMI+Ad-shPAX8-AS1組(1.25±0.08) PAX8-AS1表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。與AMI+Ad-shCon組比較，AMI+Ad-shPAX8-AS1組PAX8-AS1表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠心肌組織梗死面積的比較

與Sham+Ad-shCon組比較，Sham+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR均增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與AMI+Ad-shCon組比較, AMI+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

與Sham+Ad-shCon組比較, Sham+Ad-shPAX8-AS1組心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)均增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與AMI+Ad-shCon組比較，AMI+Ad-shPAX8-AS1組心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.5 各組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與Sham+Ad-shCon組比較, Sham+Ad-shPAX8-AS1組Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3陽性表達(dá)率及蛋白水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組Bax及cleaved-caspase3陽性表達(dá)率及蛋白水平上調(diào), Bcl-2陽性表達(dá)率及蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與AMI+Ad-shCon組比較, AMI+Ad-shPAX8-AS1組Bax及cleaved-caspase3陽性表達(dá)率及蛋白水平下調(diào), Bcl-2陽性表達(dá)率及蛋白水平上調(diào)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

A: TTC染色觀察各組小鼠的AMI圖; B: 各組小鼠的IS/ARR, 與AMI+Ad-shCon組比較, *P<0.05。

A: TUNEL染色圖; B: 凋亡指數(shù), 與Sham+Ad-shCon組比較, ?P<0.05; 與AMI+Ad-shCon組比較, #P<0.05。圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡TUNEL染色圖及凋亡指數(shù)(放大倍數(shù)100倍)

A: Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3免疫組化圖(放大倍數(shù)400倍); B: Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的陽性表達(dá)率; C: Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的免疫印跡圖; D: Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)統(tǒng)計值, 與Sham+Ad-shCon組比較, ?P<0.05; 與AMI+Ad-shCon組比較, #P<0.05。圖4 各組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

AMI是由冠狀動脈急性、持續(xù)缺血缺氧造成心肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重可導(dǎo)致患者AMI后心力衰竭，危及其生命安全[1]。因此, AMI后心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的進(jìn)一步研究，對該病的治療及預(yù)后改善具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)屬于長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，雖然蛋白編碼潛能低，但可通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制對編碼基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)，參與一系列關(guān)鍵的生理、病理過程[7]。

PAX8-AS1分布于PAX8上游的2q13染色體上[8]。PAX8-AS1是PAX8的潛在調(diào)控因子[9]。吳漪皓等[10]研究報道ALK3/Pax8通路可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡參與心臟的發(fā)育機(jī)制。侯彬等[15]研究發(fā)現(xiàn)PAX8-AS1在鼻咽癌組織和相關(guān)細(xì)胞株中均異常表達(dá)，上調(diào)PAX8-AS1可影響下游相關(guān)信號通路的活化，抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲。YU X等[4]研究表明PAX8-AS1-N(PAX8-AS1的一種轉(zhuǎn)錄本)可通過與miR-17-5p結(jié)合，上調(diào)miR-17-5p靶基因的表達(dá)，如磷酸酶和張力蛋白同系物基因、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子1A，降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。LU Y等[3]研究表明，與心絞痛患者相比，AMI患者血液lncRNA表達(dá)譜存在顯著表達(dá)差異, PAX8-AS1呈高表達(dá)水平。因此，本研究推測PAX8-AS1可能通過調(diào)節(jié)其下游因子的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的凋亡，參與AMI的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn), AMI組小鼠術(shù)后PAX8-AS1表達(dá)水平隨著時間的延長而增高，在術(shù)后第3天其PAX8-AS1表達(dá)水平達(dá)到最高值，并高于Sham組，隨后PAX8-AS1表達(dá)水平不明顯，而Sham組小鼠術(shù)后PAX8-AS1表達(dá)水平變化不明顯。提示PAX8-AS1水平的升高與AMI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并取其最高值的術(shù)后時間作為后續(xù)研究的觀察時間點(diǎn)?；诖耍狙芯坷肞AX8-AS1敲減實驗，沉默PAX8-AS1表達(dá)，將構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至小鼠中，以AMI術(shù)后第3天作為實驗的觀測點(diǎn)，以進(jìn)一步明確PAX8-AS1低表達(dá)對小鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示，與Sham+Ad-shCon組比較, Sham+Ad-shPAX8-AS1組PAX8-AS1表達(dá)下調(diào), AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組PAX8-AS1均上調(diào)。與AMI+Ad-shCon組比較, AMI+Ad-shPAX8-AS1組PAX8-AS1表達(dá)下調(diào)。說明本研究PAX8-AS1敲減實驗成功。此外，本研究梗死面積結(jié)果顯示，與Sham+Ad-shCon組比較，Sham+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR無明顯變化, AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR均增大。與AMI+Ad-shCon組比較, AMI+Ad-shPAX8-AS1組IS/ARR減小。提示PAX8-AS1在AMI心肌組織中表達(dá)下調(diào)可有效減少心肌梗死面積，推測PAX8-AS1低表達(dá)是治療AMI的潛在靶標(biāo)。分析原因可能與PAX8-AS1低表達(dá)通過不同的途徑調(diào)控下游基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制AMI的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常細(xì)胞受到生理或病理刺激后，使DNA內(nèi)切酶被激活，由基因控制的細(xì)胞自發(fā)性死亡過程，包括細(xì)胞凋亡、心肌缺血或梗死，抑制心肌細(xì)胞凋亡和壞死對改善AMI具有積極作用[12]。現(xiàn)階段研究較為成熟的心肌細(xì)胞凋亡途徑主要為死亡受體途徑及線粒體途徑，均可誘導(dǎo)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的活化，使細(xì)胞底物裂解及細(xì)胞凋亡; 其中cleaved-caspase3所在的激活途徑是凋亡啟動的早期事件; 由細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激觸發(fā)的線粒體途徑可導(dǎo)致Bax/Bcl-2依賴的線粒體外膜滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)道開放，易和凋亡蛋白酶激活因子1形成凋亡體，促進(jìn)胱天蛋白酶9活化，進(jìn)而激活下游效應(yīng)分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。因此, Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3常作為評估心肌細(xì)胞凋亡的典型凋亡標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham+Ad-shCon組比較，AMI+Ad-shCon組及AMI+Ad-shPAX8-AS1組凋亡指數(shù)、Bax及cleaved-caspase3陽性表達(dá)率及蛋白水平上調(diào), Bcl-2陽性表達(dá)率及蛋白水平下調(diào)。且AMI+Ad-shPAX8-AS1組Bax及cleaved-caspase3凋亡指數(shù)、陽性表達(dá)率及蛋白水平低于AMI+Ad-shCon組, Bcl-2陽性表達(dá)率及蛋白水平高于AMI+Ad-shCon組。證明了PAX8-AS1在AMI心肌組織中表達(dá)下調(diào)可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，起到抑制小鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用。分析原因可能是PAX8-AS1低表達(dá)可通過抑制miR-17-5p靶基因的表達(dá)，如磷酸酶和張力蛋白同系物基因(PTEN), 來減少心肌細(xì)胞的凋亡[4], 如WANG J Z等[15]研究表明過表達(dá)PTEN可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt和JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而其低表達(dá)對心肌凋亡具有抑制作用。

綜上所述, PAX8-AS1在AMI心肌組織中呈高表達(dá), PAX8-AS1低表達(dá)可減少梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其作用原因可能與調(diào)節(jié)凋亡蛋白有關(guān)，本研究對開展AMI的診療具有重要價值和意義。