徐 珍, 張玉芹, 韓書清

(1. 湖北省武漢市紅十字會醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 湖北 武漢, 430024;2. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室, 湖北 武漢, 430065)

P2X受體是一種快速作用的、具有陽離子滲透性的離子通道，被突觸釋放的細(xì)胞外5′-三磷酸腺苷(ATP)激活產(chǎn)生電流。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中, ATP通過作用突觸后膜上的P2X受體而直接介導(dǎo)快速的興奮性的突觸傳遞。此外, ATP在突觸前對P2X受體起作用，以調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸和谷氨酸[1-2]。既往研究主要集中在檢測兩棲動物背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元中原生的P2X受體，只有少數(shù)研究分析了乙醇對P2X受體的影響，有研究[3]對剛分離的成年大鼠海馬CA1神經(jīng)元進(jìn)行檢測，根據(jù)在DRG和海馬神經(jīng)元中的這些發(fā)現(xiàn)提出了乙醇作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要效應(yīng)因子是P2X受體。然而，這些乙醇敏感的天然P2X受體的亞基組成以及乙醇對這些天然嘌呤受體的作用位點(diǎn)尚未確定[4]。本研究旨在檢測乙醇或鋅離子(Zn2+)對爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的重組P2X3受體的影響，分析Zn2+和乙醇共同作用于P2X3受體的影響，并預(yù)測乙醇/Zn2+聯(lián)合研究可以為深入了解乙醇和Zn2+對P2X受體的作用機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、重組質(zhì)粒、藥品及試劑

成熟雌性非洲爪蟾(中國科學(xué)院生物遺傳與發(fā)育研究所提供)。大鼠頸上神經(jīng)節(jié)重組質(zhì)粒pcDNA3-P2X3由Dr. BUELL G(Glaxo Institute for Molecular Biology)構(gòu)建。OR2溶液: KCl 2 mmol/L, MgCl220 mmol/L, NaCl 82 mmol/L和HEPES(pH值7.5); 卵母細(xì)胞孵育液: KCl 2 mmol/L, NaCl 96 mmol/L, MgCl21 mmol/L, CaCl21 mmol/L, HEPES 5.0 mmol/L, 使用前高壓滅菌[5], 并加茶堿0.6 mmol/L、丙酮酸2.5 mmol/L、1%馬血清和0.05 mg/mL慶大霉素。

1.2 cRNA的體外轉(zhuǎn)錄及卵母細(xì)胞纖維注射

CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)菌，將P2X3受體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸桿菌E.coliDH5α中擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、純化、線性化，以線性化的DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄成cRNA。取成熟雌性爪蟾，冰浴麻醉，手術(shù)取卵，在HEPES液中加入0.2%的膠原酶A進(jìn)行消化，以去除卵母細(xì)胞的濾泡膜及血管膜。將卵母細(xì)胞置于孵育液中，在18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 h, 將P2X3受體的cRNA注射到卵母細(xì)胞的胞漿中，每個細(xì)胞注射40～50 nL(濃度為1 ng/nL)。設(shè)空白對照組和注射等量三蒸水的對照組，在18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用于電生理研究[6]。

1.3 雙電極電壓鉗記錄

在室溫中使用雙極電壓鉗放大器進(jìn)行記錄。將注射P2X3受體cRNA的卵母細(xì)胞置于細(xì)胞池中，電壓電極和電流電極充灌3 mmol/L的KCl溶液。電極尖端電阻在0.5～1.5 MΩ, 膜電位鉗制為-60 mV。電流電極所記錄的信號經(jīng)過放大、轉(zhuǎn)換，輸入計(jì)算機(jī)采樣和存儲，并通過計(jì)算機(jī)實(shí)時監(jiān)測。ATP、ZnCl2等均用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液配置，并將pH值調(diào)至7.4～7.6。實(shí)驗(yàn)用藥均通過8通道加藥系統(tǒng)給藥，給藥時間為30 s, 加藥時間間隔為5 min。通道電流用pCLAMP軟件記錄和分析，使用Excel和SPSS11.5軟件包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，記錄的電流振幅為峰值,n表示所研究的細(xì)胞數(shù)量。顯著性差異通過非配對t檢驗(yàn)和單向方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用CytoBench軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采樣、存儲和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理及圖表的繪制采用Sigma plot軟件。ATP/乙醇濃度-反應(yīng)曲線使用邏輯方程式獲得量-效曲線:I/Imax=100×(藥物)n/[(藥物)n+(EC50)n], 其中I/Imax表示當(dāng)前效應(yīng)和最大效應(yīng)百分比, EC50為半效能作用濃度,n為Hill系數(shù)。

第1組實(shí)驗(yàn)是在-60 mV的鉗制電位下，依次使用含6、12、25、50、100、200 mmol/L濃度的乙醇和0.3 μmol/L ATP的Ringer′s液灌流卵母細(xì)胞，記錄到不同幅值的ATP-激活電流; 此后在有或無100 mmol/L乙醇的情況下記錄ATP的量-效曲線。第2組實(shí)驗(yàn)在-60 mV的鉗制電位下，依次使用含5、10、25、40、50、100、300 μmol/L濃度的Zn2+和0.3 μmol/L ATP的Ringer′s液灌流卵母細(xì)胞，記錄下誘導(dǎo)產(chǎn)生的ATP-激活電流的幅值; 低濃度Zn2+(≤25 μmol/L)在2、5、10、25 μmol/L誘導(dǎo)的ATP激活電流的幅值; 此后在有或無100 μmol/L Zn2+的情況下記錄了ATP的量-效曲線。第3組檢測單獨(dú)使用乙醇(100 mmol/L)和低濃度Zn2+(5 μmol/L)對EC10ATP門控電流的影響。在同一卵母細(xì)胞中，檢測了乙醇和Zn2+共存對ATP門控電流的影響。

2 結(jié) 果

2.1 乙醇(5～200 mmol/L)可逆性地增強(qiáng)了爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的P2X3受體的ATP門控功能

乙醇對爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的大鼠同型P2X3受體中ATP激活電流見圖1。圖1A顯示: 5～200 mmol/L乙醇能顯著地、可逆性地、濃度依賴性地增強(qiáng)EC10ATP門控電流[單向ANOVA:F(5, 26)=12.15,P<0.001]。圖1B顯示: 應(yīng)用EC10ATP(0.3 μmol/L ATP)30 s(Vh=-60 mV)產(chǎn)生的ATP激活內(nèi)向電流，乙醇和ATP共同應(yīng)用30 s。0.3 μmol/L ATP +100 mmol/L乙醇產(chǎn)生的ATP激活電流，0.3 μmol/L ATP+200 mmol/L乙醇產(chǎn)生的ATP激活電流，當(dāng)ATP和乙醇(上水平條，左100 mmol/L, 右200 mmol/L)應(yīng)用于卵母細(xì)胞時的電流水平形態(tài)，垂直標(biāo)尺表示0.2 mA, 水平標(biāo)尺表示30 s。圖1C顯示: 連續(xù)性記錄了EC10ATP(0.3 μmol/L ATP)作用60、30、45 s(從左到右)對ATP激活電流的影響，說明了P2X3受體快速脫敏, ATP激活瞬態(tài)電流短暫性的特性。

A: 不同濃度的乙醇增強(qiáng)IATP百分比; B: 乙醇可逆性地增強(qiáng)IATP; C: IATP瞬態(tài)電流的短暫性。圖1 乙醇對IATP的影響

A: 乙醇引起IATP的量-效曲線左移; B: 100、300 μmol/L ATP對P2X3受體產(chǎn)生相似的最大效應(yīng), 100 mmol/L乙醇對300 μmol/L ATP缺乏作用。

A: 鋅離子對IATP的量-效曲線; B: 低濃度鋅離子IATP的量-效曲線。

2.2 有或無100 μmol/L乙醇情況下P2X3受體的ATP濃度-反應(yīng)關(guān)系

乙醇以變構(gòu)的方式增強(qiáng)ATP效應(yīng)，表現(xiàn)為ATP量-效曲線左移和ATP的EC50下降3倍，即從無乙醇時(2.35±0.10) μmol/L降至有乙醇時(0.97±0.12) μmol/L。乙醇不會改變Hill系數(shù)或ATP最大效應(yīng)(Emax)，說明乙醇在較高的ATP濃度(100、300 μmol/L)時缺乏作用，即乙醇對最大ATP濃度300 μmol/L產(chǎn)生的效應(yīng)無顯著影響。見圖2。

2.3 Zn2+(1～300 μmol/L)可逆性地增強(qiáng)了爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的P2X3受體的ATP門控功能

應(yīng)用EC10ATP(0.1～0.3 μmol/L ATP)30 s(Vh=-60 mV)激活產(chǎn)生ATP內(nèi)向電流。Zn2+與ATP共同作用30 s, 用藥之間的沖洗時間至少為5 min。作者發(fā)現(xiàn)了Zn2+(1～300 μmol/L)可逆性地、濃度依耐性地誘導(dǎo)了EC10ATP激活電流，濃度在100 μmol/L時電流數(shù)值趨于平穩(wěn), A圖中左下大方框放大后為圖B所示，低濃度Zn2+(≤25 μmol/L)誘導(dǎo)的ATP激活電流的濃度-反應(yīng)關(guān)系。見圖3。

2.4 有或無Zn2+情況下P2X3受體的ATP量-效曲線

Zn2+(100 μmol/L)導(dǎo)致ATP量-效曲線發(fā)生左移，在沒有Zn2+存在時, 100 μmol/L ATP激活電流的反應(yīng)曲線(Vh=-60 mV)。作者發(fā)現(xiàn)Zn2+增加了ATP的效應(yīng)，在沒有Zn2+存在下, ATP EC50是(4.59±0.26)，在Zn2+存在的情況下降至(0.87±0.01), Hill系數(shù)分別是(0.51±0.15)和(0.58±0.13); 在較高濃度ATP EC下(>70 μmol/L), Zn2+并未顯著改變當(dāng)前的反應(yīng), ATPEmax=(127.6±20.49) μmol/L, ATP+Zn2+Emax=(106.3±7.53) μmol/L,P=0.34。見圖4(每個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表5個不同卵母細(xì)胞的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)。

2.5 乙醇和Zn2+對增強(qiáng)P2X3受體有協(xié)同作用

首先，作者檢測單獨(dú)使用乙醇(100 mmol/L)和低濃度Zn2+對EC10ATP門控電流的影響。接下來(在同一卵母細(xì)胞中)，作者檢測了乙醇和Zn2+共存對ATP門控電流的影響。與作者最初的研究一致，單獨(dú)應(yīng)用乙醇或Zn2+在P2X3受體中顯著增強(qiáng)了ATP門控電流。乙醇和Zn2+聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同作用，大于單獨(dú)應(yīng)用時增強(qiáng)ATP的反應(yīng)。作者還檢測了乙醇對Zn2+最大增強(qiáng)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)共同應(yīng)用100 mmol/L乙醇和100 μmol/L Zn2+增加ATP門控電流比單獨(dú)應(yīng)用100 μmol/L Zn2+時的最大電流增加了(31.3±8.8)%, 無論用藥的順序如何，乙醇都會增強(qiáng)Zn2+引起的最大效應(yīng)。見圖5。

A: 5 μmol/L Zn2+、100 mmol/L乙醇、EC10 ATP 0.15 μmol/L對ATP激活電流的影響; B: 乙醇和Zn2+共同應(yīng)用顯著增強(qiáng)了ATP激活電流。圖5 乙醇和Zn2+對增強(qiáng)P2X3受體有協(xié)同作用

3 討 論

作者用雙極電壓鉗技術(shù)檢測了乙醇對爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的P2X3受體門控電流的影響，乙醇增強(qiáng)了ATP對P2X3受體的影響。此外，乙醇增強(qiáng)了Zn2+對P2X3受體的最大增強(qiáng)效應(yīng)，這表明乙醇和Zn2+可能在P2X3受體的不同位點(diǎn)或不同機(jī)制上起作用。在最大的ATP濃度下，乙醇對任何一種受體亞型都沒有顯著影響。有研究[7]表明, pH值和金屬離子組成可影響P2X受體功能，但這些變量在本研究中得到了控制。有研究[8]報(bào)道, ATP濃度會影響P2X受體對乙醇的敏感性，本研究通過使用等效的EC10濃度檢測乙醇抑制ATP激活電流來控制這一因素。因?yàn)樵诘蜐舛華TP的情況下，乙醇對P2X2和P2X4受體上的ATP功能的抑制更穩(wěn)定可靠(通常為EC5～20)。但是，在較高ATP水平的情況下，很難測量到乙醇的作用(例如EC50), 因?yàn)橐掖嫉囊种瞥潭鹊停沂荏w更容易發(fā)生脫敏[9]。

先前對P2X3受體介導(dǎo)的ATP門控電流的濃度-反應(yīng)關(guān)系研究表明，在30、100、300 μmol/L時，ATP激活電流的平均振幅差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 100 μmol/L ATP很容易獲得最大有效的IATP。本研究的ATP 濃度-反應(yīng)關(guān)系與之前的EC50和Hill系數(shù)方面的研究非常一致。然而，當(dāng)細(xì)胞外液含有Mg2+和Ca2+時，需要更高的ATP濃度作為最大有效ATP濃度，因?yàn)檫@些二價(jià)陽離子與ATP螯合，導(dǎo)致ATP濃度-反應(yīng)曲線右移。本研究中，作者用Zn2+取代了細(xì)胞外的Mg2+和Ca2+，因此測定的ATP最大效應(yīng)與之前一致[10-12]。

ATP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個重要的信號分子，因?yàn)槠浼せ钹堰誓苁荏w，包括ATP門控陽離子通道家族(嘌呤能P2X受體)[13]，雖然嘌呤能信號的發(fā)展背景很少受到關(guān)注，但是最近的研究[14]表明，細(xì)胞外ATP及其衍生物在祖細(xì)胞增殖、遷移、分化和突觸發(fā)生中起到重要作用。目前人們認(rèn)識到，嘌呤能信號在各種器官中起著重要的生理作用，但在疾病中也起著作用，將嘌呤能受體和外核酸酶作為治療靶點(diǎn)[15]。特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中, ATP和腺苷參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、膠質(zhì)-神經(jīng)元的相互作用和感覺傳遞，但也參與神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性疾病和多發(fā)性硬化癥。P2X3受體主要存在于背根和三叉神經(jīng)節(jié)的痛覺感受器感覺神經(jīng)元中，并在疼痛傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[16]。疼痛是一種主觀和復(fù)雜的心理過程，涉及到感覺、情感和認(rèn)知障礙，并具有復(fù)雜的潛在機(jī)制。傳統(tǒng)藥物可以很好地緩解疼痛，但由于許多不可避免的副作用，其效果不能令人滿意[17]。向嚙齒動物皮膚注射ATP可誘導(dǎo)傷害感受行為，而使用P2X3受體拮抗劑可產(chǎn)生減低對疼痛刺激敏感性的作用[18]。ATP門控P2X3受體在傷害性傳導(dǎo)中表達(dá)，在促進(jìn)有害機(jī)械刺激傳導(dǎo)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用。糖尿病神經(jīng)病變的疼痛是由大鼠通過蛋白激酶C激活背根神經(jīng)元膜上調(diào)P2X3受體引起。研究[19]發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出引起神經(jīng)損傷后機(jī)械痛是由DRG神經(jīng)P2X3受體的表達(dá)和功能增強(qiáng)引起。此外，嘌呤能受體作為酒精和其他濫用藥物的研究焦點(diǎn)，乙醇調(diào)節(jié)P2XRs可能會直接或間接地影響神經(jīng)元的活動，從而導(dǎo)致行為功能的改變。這些發(fā)現(xiàn)為P2X受體內(nèi)使用分子操作奠定了基礎(chǔ)，可用來研究和確定乙醇的分子位點(diǎn)和作用機(jī)制。