甘麗華, 李志敏, 何 泉, 楊 坤, 郭超峰

(1. 廣西中醫(yī)藥大學, 廣西 南寧, 530000; 2. 廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院, 廣西 南寧, 530000)

胃食管反流病(GERD)是由多種因素導致食管下括約肌功能障礙的胃食管動力障礙性疾病，反流、燒心是其典型癥狀，中國人群流行病學調查顯示，每周至少發(fā)作1次燒心癥狀的概率為1.9%～7.0%[1]。GERD的基礎治療方法是調整生活習慣與飲食方式，常用的治療藥物有抑酸藥、促胃腸動力藥、黏膜保護劑、抗反流藥物等。輕度食管炎的短期服藥效果較快，但停藥后癥狀易反復，難治性GERD需長期服藥，患者依從性差[2]。藥物治療效果不佳的患者可選擇胃鏡和外科手術進行抗反流，但治療風險大[3]。張嬌等[4-5]對治療GERD的中藥進行聚類分析得出，使用頻次最高的藥對是半夏-黃連。半夏能燥濕化痰，降逆止嘔，具有鎮(zhèn)靜抗炎、止嘔、抗腫瘤等藥理作用; 黃連能清熱燥濕、瀉火解毒，用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸、泄痢等疾病?，F(xiàn)代研究[6]表明，中藥半夏、黃連具有抑制胃液分泌，提高胃內pH值，抑制胃蛋白酶活性，保護胃黏膜的作用，但作用機制尚未明確。本研究采用網絡藥理學分析方法探討“半夏-黃連”治療GERD的活性成分、相關靶點及信號通路，并結合分子對接技術驗證有效成分與重要靶點間的親和關系，為“半夏-黃連”治療GERD提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 半夏-黃連活性成分及靶點預測

借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)設置生物口服利用度(OB)≥30%, 類藥性(DL)≥0.18, 篩選半夏、黃連的有效成分及活性靶點，利用通用蛋白質數(shù)據庫 Uniprot(https://www.uniprot.org/)將靶點蛋白全稱轉換成簡稱，整合靶點蛋白，刪除數(shù)據庫不存在的蛋白，最終得到半夏-黃連有效成分的靶點。

1.2 疾病靶點預測

以“gastroesophageal reflux disease”為檢索關鍵詞, “Homo sapiens”為研究對象在Gene Cards數(shù)據庫(https://www.genecards.org/)中收集GERD的相關基因。

1.3 藥物對疾病潛在靶點預測和調控網絡圖

運用R語言分析軟件R3.6.1(https://www.r-project.org/)對半夏-黃連的靶點蛋白與GERD的相關基因進行取交集操作，找出兩者的交集并繪制出Venn圖，初步預測半夏-黃連治療GERD的作用靶點。采用網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape3.7.2(http://cytoscape.org/)構建藥物-有效成分-疾病-靶基因思維關系圖，并將其關系進行可視化。

1.4 蛋白互作(PPI)網絡的構建

采用蛋白質互作平臺 STRING(https://www.string-db.org/)對“藥物有效成分-疾病相交集的蛋白”進行蛋白-蛋白相互作用的PPI網絡圖繪制并找出核心基因。

1.5 基因本體論(GO)分析與基因和基因組的京都百科全書(KEGG)分析

利用David 6.8數(shù)據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對PPI網絡中的作用靶點進行GO基因功能分析及KEGG信號通路分析。

1.6 分子對接驗證核心靶點與有效成分

采用AutoDock軟件對“藥物-有效成分-疾病-靶基因”思維關系圖中度值前5位的靶點蛋白與重要成分進行分子對接驗證。從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據庫下載核心蛋白3D結構，采用PyMol軟件分離靶點蛋白中的配體和水分子，將配體和蛋白均保存為pdb格式文件; 其次，運用AutoDock Tools軟件將核心蛋白、配體和mol2格式的化合物均轉換為pdbqt格式文件，再以配體為中心尋找活性口袋及Grid Box中心坐標; 利用AutoDock Vina軟件進行分子對接，最后選取對接結合能最低的結果，運用PyMol軟件將其可視化。

2 結 果

2.1 藥物有效成分及靶點預測

以OB>30%, DL>0.18為篩選標準，從TCMSP中共檢索出27個活性化合物，其中半夏、黃連分別有13、14個有效成分，參數(shù)信息見表1。利用UniProt 數(shù)據庫對半夏-黃連的1 883個靶蛋白進行簡稱轉換、合并去重處理后，兩者共同靶點為195個，有活性成分對應的作用靶點186個。

表1 半夏-黃連藥對活性成分

2.2 半夏-黃連調控GERD網絡圖

采用Cytoscape 軟件構建“藥物-有效成分-疾病-靶基因”思維關系圖，分析結果顯示，該網絡共有129個節(jié)點, 524條邊。根據節(jié)點度值(Degree)的大小，判斷其效果, Degree越大，說明該有效成分連接靶點數(shù)目越多，其作用越顯著，其中槲皮素(Degree=82)、黃芩苷(Degree=23)、β-谷甾醇(Degree=22)、(R)-氫化小檗堿(Degree=15)、豆甾醇(Degree=15), 見圖1。

2.3 PPI 網絡及關鍵靶點

采用R軟件對藥物的186個作用靶點及疾病的2 960個相關基因取交集后共得到106個交集靶蛋白，見圖2。利用STRING數(shù)據平臺對交集靶蛋白繪制PPI網絡圖，圖中含有106個靶蛋白和397組互作邊，其中胰蛋白酶原(PRSS1) 是游離蛋白，故將其刪除。節(jié)點代表1個蛋白，兩蛋白之間用邊相連，邊的度值由藍色變黃色表示逐漸變小，邊越粗表示核心地位越高。其中排名前5位的蛋白分子為蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、半胱天冬酶3(CASP3)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、人原癌基因(JUN)、白細胞介素-6(IL-6)。度值越大的蛋白質在整個網絡中越起關鍵作用，同時也是半夏-黃連治療GERD的關鍵靶點，見圖3、4。

2.4 “半夏-黃連”關鍵靶點的分子對接驗證

由PPI網絡圖可知，排名前5名的關鍵靶點為AKT1、IL-6、CASP3、JUN、VEGFA。采用AutoDock Vina軟件對5個關鍵靶點與活性成分槲皮素、黃芩苷、β-谷甾醇進行分子對接驗證。一般認為，配體與受體結合能越低，結合的構象越穩(wěn)定，結合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)結合。分析可知，靶點-化合物結合能從小到大排列為: IL-6與β-谷甾醇(-8.3 kcal/mol)、CASP3與β-谷甾醇(-7.1 kcal/mol)、AKT1與黃芩苷(-5.5 kcal/mol)、VEFGA與黃芩苷(-4.4 kcal/mol)、JUN與黃芩苷(-4.8 kcal/mol), 其中IL-6與β-谷甾醇(-8.3 kcal/mol)具有較強的結合力，利用Pymol軟件對接結合能最低的化合物進行可視化處理，見圖5。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

GO基因功能分析共包括969條，生物過程(BP)827條，主要包括氧化應激反應、對脂多糖反應、對細菌來源分子的反應等; 細胞組成(CC)64條，主要包括膜筏、膜微結構域、膜區(qū)域等; 分子功能(MF)78條，主要包括泛素樣分子鏈接酶、激酶調節(jié)活動、血紅素結合等。將P值排序，點越大則富集基因越多,P值越小顏色越紅。取前20條通過R軟件轉化為氣泡圖，見圖6、7、8。KEGG信號通路分析得到121條通路，主要有丙型肝炎、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、細胞衰老、PI3K/AKT信號通路等，體現(xiàn)了半夏-黃連治療過程中參與多通路的特點，見圖9。

3 討 論

GERD的發(fā)病機制包括胃食管交界處結構和功能障礙、食管清除能力與上皮防御功能失衡、食管抗反流功能下降及食管敏感性增高、免疫因素介導食管黏膜損傷等[7-8]。GERD在中醫(yī)學屬“吐酸、食管癉”范疇，病機多為木郁土虛，濕邪郁阻中焦，氣機升降失調，胃氣上逆。發(fā)病過程中會出現(xiàn)濕郁化熱、痰阻氣滯等過程，治則是清熱燥濕，祛痰降逆，兼以疏肝理氣[9]。半夏具有辛溫燥熱，祛痰降逆功效; 黃連具備苦寒降泄，清熱燥濕功能，兩藥配合，寒熱互用以和其陰陽，辛開苦降以調其升降，消濕熱之痞，化痰濁之結[4]。

本研究通過網絡藥理學及分子對接技術對“半夏-黃連”治療GERD的機制進行初步探討，共篩選出半夏-黃連活性成分27個，關鍵靶點186個。根據藥物-有效成分-疾病-靶點關系圖可知，槲皮素、黃芩苷、β-谷甾醇、(R)-氫化小檗堿、豆甾醇有較多靶點蛋白對應，表明上述化合物可能是治療GERD的關鍵活性成分。組胺廣泛分布在消化道的各種細胞中, KITANO M等[10]研究表明，組胺可刺激酸分泌和破壞細胞黏膜，槲皮素能有效抑制組胺的濃度，抑制酸的分泌，保護食管黏膜。YOH T等[11]研究發(fā)現(xiàn)，單純抑制胃酸分泌并不能改善食管下括約肌的功能，體內自由基濃度增加可引起脂質過氧化，導致活性氧升高，蛋白質及核酸變性，造成細胞組織損傷從而出現(xiàn)反酸、燒心等癥狀。槲皮素可有效清除自由基，顯著降低脂質過氧化，保護組織黏膜[12]。黃芩苷也具有抗氧化作用，能清除氧自由基的來源，減少組織損傷，延緩細胞衰老[13]。此外，黃芩苷可降低CASP3和Bax水平，調節(jié)PI3K/Akt信號通路表達，改善受損的血管內皮功能和調節(jié)氧化應激反應[14]。PANDITH H等[15]通過體外試驗發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能抑制脂多糖(LPS)誘導的環(huán)氧酶2(COX-2)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS) mRNA水平提高，下調前列腺素E2(PGE2)和NO的釋放，維持黏膜屏障功能。β-谷甾醇除具有清除羥自由基的抗氧化作用外，還可增加抗菌肽表達，在細菌作用位點結合，起殺死致病菌的作用; 同樣β-谷甾醇通過抑制表皮細胞、巨噬細胞及MAPK信號通路的激活，導致TNF-α、IL-6和白細胞介素-8(IL-8)生成減少從而起到抗炎作用[16]。(R)-氫化小檗堿是黃連素的衍生物，動物實驗[17]顯示氫化小檗堿具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

由PPI網絡圖可知，相互作用關系較多的靶點是AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、IL-6, 這些靶點通過各種聯(lián)系參與多種生物過程。食管功能改變和食管黏膜損傷是GERD重要發(fā)病機制，除外化學損傷還可能涉及自身免疫。研究[18]表明賁門失弛緩癥患者的血清和血漿中發(fā)現(xiàn)IL-6明顯升高, IL-6是重要的免疫調節(jié)因子及炎癥介質，PALMIERI O等[19]研究證明, IL-6在賁門失弛緩癥中造成神經損傷并介導炎癥反應的發(fā)生。腫瘤血管的形成對實體腫瘤存活至關重要, VEGFA是促進腫瘤血管形成的重要因子，可刺激血管內皮細胞增殖，介導腫瘤血管的形成，主要通過與血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)結合激活酪氨酸激酶，使自身磷酸化，觸發(fā)級聯(lián)反應，促進腫瘤血管新生[20]。CASP3是細胞凋亡信號通路中的關鍵位點，介導外部和內在的線粒體通路，催化多種蛋白特異性裂解，降解細胞目標，觸發(fā)細胞凋亡[21]。AKT1參與細胞增殖生長、代謝和血管生成等多種過程，是PI3K/Akt信號通路上的關鍵基因, PI3K/Akt信號通路可刺激食管腫瘤細胞增殖轉移，而磷酸化AKT1可使食管癌患者局部組織生存期縮短[22]。JUN是活化蛋白1(AP-1)構成單位之一，在食管癌表達中抑制AP-1轉錄活性，阻斷信號通路傳導，可抑制食管癌腫瘤細胞增殖[23]。

KEGG通路分析可知，半夏-黃連可通過PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路及NF-κB信號通路發(fā)揮治療GERD的作用。AutoDock Vina分子對接結果顯示，半夏-黃連與GERD的作用靶點有較好的結合活性，其中結合力最強的是IL-6與β-谷甾醇。VEGFA信號通路是抗食管癌血管形成的治療靶點, VEGF是PI3K/Akt信號通路激活的膜受體, VEGF過度活化可誘導食管黏膜組織相關癌變。張鋒利等[24]實驗證實，降低VEGF表達水平，抑制PI3K/Akt信號通路活化，能夠有效抑制正常細胞向癌細胞的增殖分化。MAPK信號通路通過誘導通路上位點Hsp70和Hsp27發(fā)揮食管血管內皮細胞對酸性物質的應激反應，減少黏膜損傷[25]。炎癥因子是參與破壞食管黏膜屏障的因素之一，人食管黏膜細胞內白細胞介素-1β(IL-1β)和 IL-8炎癥因子的表達，可激活食管黏膜內NF-κB信號通路，該通路的激活促使大量炎癥細胞聚集，開啟炎癥級聯(lián)反應。同時炎癥因子可阻斷緊密連接蛋白表達與分布，加重反流對食管黏膜上皮的損害[26]。

本研究通過網絡藥理學對半夏-黃連藥對治療GERD的有效成分、作用靶點及相關通路進行了初步探索，并通過Autodock分子對接軟件驗證了半夏-黃連核心成分與關鍵靶點之間存在較好結合度，有效證明了網絡藥理學預測靶點的可靠性。結果顯示，半夏-黃連可能將活性成分槲皮素、黃芩苷、β-谷甾醇作用于AKT1、IL-6、CASP3等靶點，調控PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路及NF-κB信號通路，參與炎癥反應、氧化反應、細胞凋亡等生理病理過程以發(fā)揮治療GERD的作用。但本研究缺乏動物實驗驗證，且數(shù)據庫信息更新不及時，因此也具有一定的不足之處。