李經(jīng)增,紀明開,林心瑜,張 良,蘇良寶

(1.三明市皮膚病醫(yī)院,福建 三明 365000;2.福建醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,福建 福州 350000;3.廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院,福建 廈門 361000;4.復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院,福建 廈門 361000;5.泉州市安溪縣醫(yī)院,福建 泉州 362400)

乳房外Paget病(EMPD)是好發(fā)于頂泌汗腺數(shù)量較集中、非曝光區(qū)域的惡性皮膚腺癌，表現(xiàn)為不對稱擴大的發(fā)展過程且特殊類型的異位性EMPD可累及口腔黏膜及口腔周圍、腋窩、下腹部等處。本研究應用免疫組織化學(免疫組化)檢測核因子受體激活因子κB配體(RANKL)，磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶-1/2(p-ERK1/2)，磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)在EMPD中的表達，探討3條信號通路的生物學意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 80例確診為EMPD患者于2008-2017年在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科及福建省皮膚性病防治院就診，其中男70例，發(fā)病年齡51～86歲，平均(64.48±8.19)歲；女10例，發(fā)病年齡51～73歲，平均(59.6±6.87)歲；發(fā)病至確診時間2～60個月，平均(28.8±3.6)個月。

1.2方法 采用免疫組化檢測患者標本中RANKL，p-ERK1/2，p-mTOR的表達。

1.2.1試劑 使用北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)的免疫組化試劑，實驗步驟參照試劑盒說明書進行?？贵w稀釋比率均為1∶200。

1.2.2結果判定 選取5個高倍視野進行陽性細胞平均百分比、染色強度評分。陽性細胞占細胞總數(shù)比例小于5%計0分，5%～25%計 1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%計4分。染色強度評分：細胞核無染色計0分，散在分布淺棕色或淺紅色計1分，彌漫分布棕色或紅色計2分，彌漫分布深棕色或深紅色計3分。依兩項之和判定：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5分及以上為強陽性(+++)[1]。

2 結 果

2.1RANKL在EMPD中的表達 RANKL定位于腫瘤細胞的細胞核，陰性(-)14例，弱陽性(+)11例，陽性(++)23例，強陽性(+++)32例，見圖1。

2.2p-ERK1/2在EMPD中的表達 p-ERK1/2定位于腫瘤細胞的細胞核，陰性(-)11例，弱陽性(+)15例，陽性(++)18例，強陽性(+++)36例，見圖2。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

2.3p-mTOR在EMPD中的表達 p-mTOR定位于腫瘤細胞的細胞核，陰性(-)9例，弱陽性(+)12例，陽性(++)18例，強陽性(+++)41例，見圖3。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

2.4RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR的相關性 RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR在EMPD中陽性表達呈正相關[相關系數(shù)(r)=0.907、0.931、0.998，P<0.05]，見表1。

表1 RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR的相關性

3 討 論

RANKL主要由細胞內結構域、跨膜結構域和細胞外腫瘤壞死因子(TNF)家族同源區(qū)共同組成。當RANKL識別到激活信號時，其可誘導受體發(fā)生構象改變形成三聚體，與TNF適配蛋白形成復合體。RANKL與T細胞依賴性免疫反應有關及在CD4+、CD8+中表達和T細胞的受體刺激是相一致的[2]，可耐受性誘導甚至還可能上調腫瘤細胞的抗凋亡通路，在多種癌細胞中均可表達與腫瘤病程相關[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，EMPD腫瘤組織中RANKL表達的陽性率高達82.5%，提示腫瘤細胞通過RANKL這個媒介誘導其增殖分化，推測在疾病的初始階段正常組織細胞由于多種因素的影響下發(fā)生突變產(chǎn)生Paget細胞，繼而激活RANK-RANKL細胞信號通路，在此過程中RANKL通過調節(jié)朗格漢斯細胞和T細胞的亞群及M2巨噬細胞以自分泌或旁分泌的形式釋放多種多樣的炎癥細胞因子來誘導Paget細胞的增殖、遷徙或轉移，甚至進一步發(fā)展突破真皮層或圍繞在附屬器周圍轉為侵襲性EMPD。另外，Paget細胞在上述炎癥因子、信號通路的多重激發(fā)下，通過腫瘤細胞自身的某些產(chǎn)物加強了RANKL的表達或通過級聯(lián)放大效應促進了免疫耐受、抑制性T細胞的免疫活化甚至介導了腫瘤細胞表面異常免疫屏障等生物學行為來促使免疫抑制微環(huán)境的形成，讓Paget細胞逃避免疫監(jiān)測，擺脫了正常的細胞凋亡調控機制而呈特征性的跳躍式生長。

RAS-RAF-MEK-ERK簡稱為MAPK通路。ERK分為ERK1和ERK2，它們激活是通過MEK催化酪氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化來實現(xiàn)，它們發(fā)揮效應后對細胞增殖和存活過程意義非常大。WANG等[4]發(fā)現(xiàn)ERK1/2促進了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可以作為一個治療靶點的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)80例EMPD中有69例呈陽性表達，其中強陽性(+++)有36例，這也提示ERK1/2參與了EMPD發(fā)生、發(fā)展過程。依研究結果推測ERK細胞信號通路促進了Paget細胞的有絲分裂和激素受體信號轉導，而且腫瘤細胞不間斷持續(xù)生長離不開細胞因子、血管淋巴管、營養(yǎng)物質的支持，而ERK信號通路在發(fā)生作用的同時也離不開這些要素，Paget細胞在ERK的影響下加速了其增殖、轉移、跳躍式生長，部分發(fā)展到真皮成為侵襲性EMPD。

mTOR的主要特征是其具有調節(jié)細胞的生長、增殖和代謝[5]的作用并作為腫瘤治療的靶點受到了廣泛的關注[6]。mTOR的磷酸化要與相應復合物結合，具有活性后[7]才能進入負調控自噬[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，一方面，在結腸直腸癌中p-mTOR過表達可能參與疾病的發(fā)展，增加癌細胞蛋白分泌、縮短細胞周期，導致癌細胞的無限制增長[9]；另一方面，其還可能打亂正常細胞凋亡過程，增加異常細胞存活、血管增生[10]，如在乳腺癌中高表達對患者生存預后有著非常不利的影響[11]。p-mTOR信號軸還可能是促進非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲的關鍵分子[12]。本研究中，p-mTOR的表達程度最高達71例，陽性率為88.75%，推測EMPD中Paget細胞生成后借助AKT協(xié)調腫瘤細胞有絲分裂信號，通過mTOR影響蛋白質合成，在一定程度上是血管生成、延展的中樞調節(jié)因子，可能促進了癌細胞蛋白的分泌。mTOR信號通路激活后讓突變而來的Paget細胞在G1、S期階段調控紊亂脫離正常細胞周期，促使其持續(xù)過度生長，可能與異常血管、淋巴增生及在瘤細胞凋亡、侵襲力、轉移等方面發(fā)揮了重要的作用。

通過計算RANKL、p-ERK1/2和p-mTOR三者在EMPD中陽性表達程度統(tǒng)計得出彼此之間呈正相關，這與以下學者的實驗結果基本一致。張凌云等[13]對乳腺癌、JONES等[14]對骨轉移腫瘤均提出ERK參與了RANKL誘導腫瘤細胞的增殖、遷徙和轉移。王妍等[15]采用流式技術表明惡性腫瘤中RANKL會激活AKT和ERK，同時借助以上3條信號通路來促使病情的變化與發(fā)展、增殖與轉移。據(jù)此可以推測RANKL在EMPD中通過了這2條信號通路激活p-ERK1/2、p-mTOR，促使其高表達，在一定程度上促進了其信號通路的轉導、表達，促使Paget細胞的生長、增殖，甚至侵襲和轉移。

綜上所述，乳房外Paget病中RANKL、p-ERK1/2、p-mTOR的過度表達且呈正相關。提示相關信號通路在病程發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉移過程中起著重要作用，可能共同促進了腫瘤細胞的生長、增殖和轉移，增加了疾病的侵襲性。