嚴 潔，肖云華

(1.重慶市紅十字會醫(yī)院/江北區(qū)人民醫(yī)院放射科；重慶 400020;2.重慶市大足區(qū)婦幼保健院放射科，重慶 402360；3.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 400038)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)發(fā)布2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，中國的癌癥發(fā)病率和死亡率均為全球第一，約有50%的胃癌、肝癌和食道癌病例來自中國，雖然肝癌在中國的總體發(fā)病率排名第五位，但大約55%的肝癌患者在確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，使得肝癌死亡率排名第二位[1]。美國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)也顯示，在肺癌等癌癥發(fā)病率逐年下降的趨勢下，肝癌發(fā)病率仍然持續(xù)上升[2]。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)都充分顯示肝癌防治任務重要而緊迫。

放療(RT)已廣泛用于全身各種實體腫瘤治療，但傳統(tǒng)體外RT對正常肝組織損傷較大，限制了RT在肝癌治療中的應用[3-4]。近年來，以125I放射性粒子植入為代表的近距離輻射治療因為腫瘤內累積輻射劑量高、對周圍正常組織損傷小而逐漸在臨床推廣應用[5]。雖然放射性粒子植入治療肝癌取得了較好的臨床治療效果，但仍然需要進一步提高RT敏感度，減少輻射劑量及患者醫(yī)療費用負擔。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有廣泛的生物學功能，涉及染色體劑量補償效應、基因組印跡、染色體沉默、染色質修飾與重塑、細胞分化、基因轉錄與翻譯調控、細胞結構完整性的維持、細胞周期調節(jié)、細胞內物質轉運、干細胞重新編程和熱休克反應等重要生命活動過程,并且能夠調控肝癌的RT敏感度[6-8]。125I放射性粒子是否引起肝癌細胞lncRNA表達變化，以及l(fā)ncRNA在近距離輻射誘導肝癌細胞死亡過程中的作用，尚鮮有文獻報道，本研究對此進行探索并報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株及主要試劑 人肝癌Hep3B細胞株來源于陸軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生化教研室。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、PBS均購自 Hycolone公司。125I粒子活度29.6 MBq(0.8 mCi)為寧波君安藥業(yè)科技有限公司產(chǎn)品(批號：JA-210219)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌Hep3B細胞株接種于10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，細胞長滿時用 0.25% 胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行輻射。

1.2.2細胞輻射方式 將人肝癌Hep3B細胞分為實驗組(125I組)和對照組(NC組)。125I 放射性粒子輻照模式參照參考文獻[9]，采用9顆初始活度為29.6 MBq(0.8 mCi)、初始劑量率為5.32 cGy/h的粒子，其中 1 顆粒子位于圓形環(huán)中央，8顆粒子以35 mm直徑等距環(huán)形排布。125I組對數(shù)生長期細胞置于 35 mm 培養(yǎng)皿內粒子輻射裝置上方 5 mm處，給予6 Gy 劑量輻射，所有輻射過程均在細胞培養(yǎng)箱中進行。NC組細胞放于同一細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)(輻照模型設置了鉛防護，不會對NC組細胞造成輻射)。

1.2.3LncRNA提取及測序 按照上述方法對人肝癌Hep3B細胞株進行輻照處理作為125I組樣本。通過經(jīng)典的TRIzol法提取125I組及NC組的總RNA，將總RNA溶于無RNase的水中，保障樣本濃度大于100 ng/μL，體積大于35 μL。lncRNA測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司(中國北京)進行，采用去除核糖體RNA的方法構建鏈特異性文庫[10]。首先，從總RNA中去除核糖體RNA，隨后將RNA打斷成250～300 bp的短片段，以片段化的RNA為模板，隨機寡核苷酸為引物合成cDNA第一條鏈，隨后用RNase H降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs(dUTP、dATP、dGTP和dCTP)為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選350～400 bp的cDNA。使用USER酶降解含U的cDNA第二鏈，最后進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增并獲得文庫。對文庫進行Qubit初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，再用Agilent 2100 bioanalyzer檢測對文庫的插入片段長度進行檢測，分布在250～300 bp為符合預期。庫檢合格后，根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進行Illumina PE150測序。

1.2.4LncRNA生物信息分析 LncRNA測序獲得原始數(shù)據(jù)后進入信息分析流程，流程分為2個階段：測序數(shù)據(jù)質量評估及l(fā)ncRNA信息挖掘。原始數(shù)據(jù)質控合格后進行后續(xù)信息挖掘，包含lncRNA表達量分析、差異lncRNA分析、GO功能富集等分析。

1.2.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 驗證輻射應答性lncRNA125I組及NC組樣本分別提取總RNA并用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR，引物由Genecopoeia 公司設計合成，測定差異lncRNA的表達水平。qRT-PCR實驗使用標準實驗步驟(Tm=60 ℃)進行，50次循環(huán)，以管家基因GAPDH作為實驗內參。結果用2-ΔΔCt相對定量法計算各組、各基因的相對表達量。然后用GraphPad Prism 8對125I組和NC組作圖，并用其自帶統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。

采用Hisat2將clean reads比對到參考基因組上[11]，使用Stringtie軟件在基于比對到基因組上的結果，將reads拼接成轉錄本[12]。 使用Cuffmerge軟件對各樣本拼接得到的轉錄本進行合并，去掉其中鏈方向不確定和轉錄本長度不超過200 nt的轉錄本，接下來利用Cuffcompare軟件跟已知數(shù)據(jù)庫進行比較，得到已知的lncRNA和Novel_lncRNA，并使用StringTie對lncRNA進行定量分析[13]。

2 結 果

2.1125I放射性粒子近距離輻射影響肝癌細胞lncRNA表達譜變化 測序結果顯示，125I組lncRNA原始數(shù)據(jù)為13.78 G，NC組lncRNA原始數(shù)據(jù)為12.97 G，測序數(shù)據(jù)質量評估見表1，合格判斷標準為Q20≥90%、Q30≥85%。

表1 lncRNA測序數(shù)據(jù)質量評估

差異lncRNA篩選標準為|log2FoldChange|>4且padj<0.01，本次實驗中得到9 206個差異lncRNAs轉錄本，其中上調4 556個，下調4 650個，差異lncRNAs轉錄本情況如圖1所示。

2.2LncRNA的qRT-PCR驗證 為了進一步驗證lncRNA測序的準確性，從9 206個差異lncRNAs轉錄本中挑出顯著差異的6個lncRNAs轉錄本進行qRT-PCR驗證。分組設置分別為125I放射性粒子輻射照射實驗組、非輻射照射對照組，通過qRT-PCR得到6種lncRNAs轉錄本在不同處理細胞中的表達水平，實驗發(fā)現(xiàn)這5種lncRNAs轉錄本的表達量變化趨勢和測序結果一致(圖2)，其中XLOC_002662、CBSL的表達水平顯著降低，XLOC_076363、TMEM189-UBE2V1、AC025165.3的表達水平顯著升高，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);AP002990.1基因表達趨勢雖然與預測結果一致，但兩組表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3LncRNA的功能預測 LncRNA生物學功能豐富，廣泛參與生物體各類重要生理過程，可在轉錄水平和轉錄后水平上對靶基因的表達進行調控，并找出不同處理產(chǎn)生的差異功能通路。通過lncRNA與蛋白編碼基因的位置關系(co-location)預測lncRNA的靶基因，然后對差異lncRNA的靶基因進行功能富集分析，以此來預測lncRNA的主要功能。

對本次檢測出的9 206個差異lncRNAs轉錄本進行靶基因GO功能富集分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)差異lncRNAs轉錄本的靶基因主要功能集中在自噬體形成、DNA損傷等方面，即相關差異lncRNAs在受到輻射影響后參與細胞增殖的調控。

A.樣本火山圖；B.差異lncRNAs轉錄本熱圖。

與NC組比較，a P<0.05,b P>0.05。

圖3 6 Gy125I放射性粒子輻照與未經(jīng)輻照的Hep3B細胞差異lncRNAs GO功能富集圖

3 討 論

近年來，以125I放射性粒子植入為代表的近距離輻射治療因腫瘤內累積輻射劑量高、對周圍正常組織損傷小而逐漸在臨床推廣應用[14-15]，取得了較好的臨床治療效果。然而研究者對125I放射性粒子誘導肝癌細胞死亡、RT抵抗、增強RT敏感性的分子機制報道較少，特別是關于125I輻射導致的肝癌細胞lncRNA表達譜變化目前不十分清楚。為了探索相關問題，作者通過設置6 Gy125I放射性粒子輻照125I組與未經(jīng)輻照的NC組進行l(wèi)ncRNA測序分析，研究其表達譜的變化情況，以期待探索新的機制、生物標志物和干預靶點，提高125I放射性粒子在肝癌RT中的臨床應用價值。

通過本次lncRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，9 206個差異表達lncRNAs，其中上調4 556個，下調4 650個；對差異lncRNA轉錄本進行靶基因GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)其主要功能集中在自噬體形成、DNA損傷等方面，即相關差異lncRNA在受到輻射影響后參與細胞增殖的調控，這與已報道的電離輻射損傷染色體、影響細胞有絲分裂研究結果相吻合[16]。從目前檢索的文獻情況來看，這是首次報道肝癌細胞經(jīng)過125I放射性粒子照射后lncRNA表達譜的變化，本次研究為近距離輻射誘導肝癌細胞死亡分子機制、尋找新的RT標志物及干預靶點提供了新的研究思路。本研究選取表達差異較大的6個基因(|log2FoldChange|>8且padj<0.01)進行了qRT-PCR驗證，6個lncRNAs分別分布于chr12、chr5、chr20、chr1、chr11、chr21，分子長度在275～1 225 nt，平均長度632 nt。qRT-PCR驗證結果顯示其表達趨勢與lncRNA測序結果相吻合。查閱NCBI基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)：XLOC_002662表達與細胞死亡抑制調節(jié)功能相關；CBSL與水解酶催化轉硫途徑的第一步有關，還參與硫化氫的產(chǎn)生，而硫化氫是一種對細胞具有保護作用的氣體傳遞物質；TMEM189-UBE2V1是相鄰TMEM189和UBE2V1基因的一種罕見但自然發(fā)生的通讀轉錄物，其通過mRNA讀取的意義及其蛋白產(chǎn)物的功能尚未確定；AC025165.3參與蛋白編碼調節(jié)；XLOC_076363在該數(shù)據(jù)庫中還沒有功能注解。這些功能注解提示lncRNA廣泛參與125I放射性粒子誘導細胞死亡的過程，其詳細機制紛繁復雜，需要在今后的研究實踐中進一步探索。

本次實驗驗證的基因數(shù)目較少，并且沒有繼續(xù)對這些基因進行更加深入的功能和機制研究，是本實驗的局限性。此外，選擇實驗的細胞株單一也是本次實驗的局限性之一。在后續(xù)實驗中，作者將進一步探討lncRNA在125I放射性粒子誘導肝癌細胞死亡過程中的分子機制。

總之，通過對125I放射性粒子輻照后的肝癌Hep3B細胞進行l(wèi)ncRNA測序，發(fā)現(xiàn)大量lncRNA參與了染色體損傷、細胞分裂增殖過程，這為進一步探索電離輻射誘導腫瘤細胞死亡分子機制、尋找RT生物標志物和干預靶點提供了新思路。