周智華，杜瓊穎，郅青

急性心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，介入或溶栓等再灌注治療是其急診的有效療法，及時再通冠狀動脈（冠脈）、恢復(fù)缺血心肌血供，可明顯減輕心肌損傷。但治療后心肌會發(fā)生缺血再灌注損傷，造成梗死面積擴(kuò)大、惡性心律失常及心力衰竭發(fā)生風(fēng)險的增加，對再灌注療效產(chǎn)生不利影響，需積極防治[1,2]。心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)胞自噬在心肌再灌注過程中起到重要作用。多項研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注心肌中細(xì)胞自噬明顯激活，使用自噬激動劑雷帕霉素能夠減輕心肌損傷、使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）能加重心肌損傷[3,4]。自噬成為近年來防治心肌缺血再灌注損傷的熱門靶點之一。

β-石竹烯是一類雙環(huán)倍半萜型天然物質(zhì)，廣泛存在于肉桂、丁香等植物中，具有抗凋亡、促自噬等生物學(xué)作用。腦缺血再灌注相關(guān)的動物實驗發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯能夠減輕腦缺血再灌注損傷并激活缺血腦組織的自噬，增加自噬標(biāo)志基因beclin-1及LC3-II/LC3-I的表達(dá)[5]，但其在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制不楚。本研究將在心肌缺血再灌注損傷小鼠中觀察β-石竹烯激活自噬減輕心肌損傷的作用及機(jī)制，旨在為發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷新的防治藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物雄性C57BL/6J小鼠購自賽業(yè)模式生物研究中心（太倉）有限公司，體質(zhì)量18～24 g，許可證號：SCXK(蘇)2018-0003。

1.2 試劑與儀器β-石竹烯、3-MA購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)公司，TTC染色液購自南京森貝伽公司，HE染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）一抗購自CST公司。正置顯微鏡為蘇州上光儀器有限公司，透射電鏡為上海斯坦德檢測公司，凝膠電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.3 動物分組、造模及給藥實驗動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、β-石竹烯組、3-MA組、β-石竹烯+3-MA組共五組，每組各16只。假手術(shù)組：進(jìn)行麻醉、開胸、分離冠脈等手術(shù)操作，但不結(jié)扎；模型組：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后氣管插管、連接小動物呼吸機(jī)，開胸并分離左前降支，結(jié)扎縫線、使心肌缺血30 min，而后剪斷結(jié)扎的縫線、使心肌再灌注2 h，心電圖監(jiān)測ST段改變；β-石竹烯組：給予72 mg/kg β-石竹烯灌胃，1/d，連續(xù)5 d，末次灌胃后1 h按照模型組的方法行心肌缺血再灌注造模；3-MA組：造模前15 min給予15 mg/kg 3-MA腹腔注射，而后按照模型組方法進(jìn)行心肌缺血再灌注造模；β-石竹烯+3-MA組：給予72 mg/kg β-石竹烯灌胃，1/d，連續(xù)5 d，末次灌胃后1 h按照模型組的方法進(jìn)行心肌缺血再灌注造模，造模前15 min給予15 mg/kg 3-MA腹腔注射。

1.4 血清心肌酶含量的檢測經(jīng)心臟取血1.0～1.5 ml，靜置0.5 h后自然凝血，3000轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清后檢測LDH和CK-MB含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5 心肌TTC染色每組小鼠隨機(jī)選擇8只，取心臟在-80℃冰凍1 h，制成2 mm切片、5～6片，將切片放入1%TTC染色液中，37℃避光染色30 min。完成后磷酸鹽緩沖液清洗3遍，數(shù)碼相機(jī)拍照記錄并在Image J軟件中分析心肌梗死面積，梗死心肌呈灰白色、未梗死心肌呈磚紅色，按照公式（心肌梗死面積之和/全心面積之和）×100%計算心肌梗死面積。

1.6 心肌HE染色每組小鼠剩余8只，取缺血再灌注的心肌組織適量，4%多聚甲醛固定后制作病理切片，HE染色試劑盒行染色操作，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察心肌病理改變。

1.7 自噬小體的檢測取缺血再灌注的心肌組織適量，制成約1 mm3的組織塊，在2.5%戊二醛溶液中固定并保存，檢測時用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗組織塊3次，放入1%鋨酸中、4℃固定1 h，經(jīng)70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，-80℃聚合24 h，制作成60～70 nm厚度的切片并用3%檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個視野對自噬小體進(jìn)行計數(shù)。

1.8 自噬基因表達(dá)的檢測取缺血再灌注的心肌組織適量，采用RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白含量，取含有30 μg蛋白的樣本進(jìn)行western blot檢測，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，4℃孵育1:1000稀釋的 Beclin-1、LC3一抗或1:2500稀釋的β-actin一抗過夜，洗膜3次后室溫孵育1:2000稀釋的二抗1 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶并計算灰度值，以Beclin-1/β-actin、LC3-II/LC3-I的比值作為表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠心電圖的比較五組小鼠心電圖的變化（圖1）。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.05）；與模型組比較，β-石竹烯組小鼠心電圖ST段明顯降低，3-MA組小鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.05）；與β-石竹烯組比較，β-石竹烯+3-MA組小鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.05），表1。

表1 五組小鼠心電圖ST段的比較（n=16）

圖1 五組小鼠心電圖的變化

2.2 五組小鼠血清心肌酶含量的比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，β-石竹烯組小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯降低，3-MA組小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P＜0.05）；與β-石竹烯組比較，β-石竹烯+3-MA組小鼠血清中LDH、CK-MB的含量明顯增加（P＜0.05），表2。

表2 五組小鼠血清LDH、CK-MB含量的比較（n=16）

2.2 五組小鼠心肌梗死面積的比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，β-石竹烯組小鼠的心肌梗死面積明顯降低，3-MA組小鼠的心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05）；與β-石竹烯組比較，β-石竹烯+3-MA組小鼠的心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05），圖2。

圖2 五組小鼠心肌梗死面積的比較（TTC染色）

2.3 五組小鼠心肌病理改變的比較假手術(shù)組心肌HE染色可見細(xì)胞排列整齊、呈束狀分布；模型組心肌HE染色可見細(xì)胞腫脹且排列混亂、大量炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變；β-石竹烯組心肌HE染色可見病理改變較模型組改善，3-MA組心肌HE染色可見病理改變較模型組加重；β-石竹烯+3-MA組心肌HE染色可見病理改變較β-石竹烯組加重（圖3）。

圖3 五組小鼠心肌病理改變的比較（HE染色）

2.4 五組小鼠心肌中自噬小體的比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌中自噬小體數(shù)目明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，β-石竹烯組小鼠心肌中自噬小體數(shù)目明顯增加， 3-MA組小鼠心肌中自噬小體數(shù)目明顯減少（P＜0.05）；與β-石竹烯組比較，β-石竹烯+3-MA組小鼠心肌中自噬小體數(shù)目明顯減少（P＜0.05），圖4。

圖4 五組小鼠心肌中自噬小體的比較

2.5 五組小鼠心肌中自噬標(biāo)志基因表達(dá)的比較與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，β-石竹烯組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表達(dá)水平明顯增加，3-MA組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表達(dá)水平明顯減少（P＜0.05）；與β-石竹烯組比較，β-石竹烯+3-MA組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I的表達(dá)水平明顯減少（P＜0.05），見圖5及表3。

表3 五組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II/LC3-I表達(dá)的比較（n=16）

圖5 五組小鼠心肌中Beclin-1、LC3-II、LC3-I的蛋白條帶

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是影響急性心肌梗死再灌注治療效果的重要因素，防治心肌缺血再灌注損傷是近年來心血管研究的熱點。β-石竹烯是廣泛存在于多種植物中的雙環(huán)倍半萜化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物學(xué)作用。多項腦缺血再灌注相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯能夠減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)損害[5-7]；另有研究發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯在腦出血、衰老、抑郁等動物模型中也起到神經(jīng)保護(hù)作用[8-10]。本研究將β-石竹烯用于心肌缺血再灌注損傷的治療。在小鼠心肌缺血再灌注損傷造模前給予β-石竹烯灌胃干預(yù)并觀察到：心電圖ST段及血清中心肌酶LDH及CK-MB含量降低、梗死面積縮小、病理改變減輕，表明β-石竹烯能夠減輕小鼠心肌再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，涉及凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激、自噬等環(huán)節(jié)[11-13]。自噬是細(xì)胞通過溶酶體吞噬衰老、受損蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的過程，有助于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬小體形成是自噬激活的特征，而Beclin-1和LC3兩種基因在自噬小體形成過程中起關(guān)鍵作用、其表達(dá)也能反映自噬的激活程度[14-16]。既往心肌缺血再灌注損傷[17]、心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷[18]相關(guān)研究及本研究均發(fā)現(xiàn)：自噬在心肌缺血再灌注損傷過程中被激活，缺血心肌中自噬小體增多、Beclin-1及LC3-II/LC3-I的表達(dá)增加。本研究進(jìn)一步在心肌缺血再灌注造模前給予自噬抑制劑3-MA干預(yù)，旨在闡明自噬激活在心肌缺血再灌注損傷中的作用，結(jié)果顯示：3-MA預(yù)處理能夠加重心肌缺血再灌注損傷的程度，表明自噬激活具有心肌保護(hù)作用，心肌缺血再灌注過程中自噬的激活可能是一種自我保護(hù)的代償機(jī)制。

自噬是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，在腦缺血再灌注過程中細(xì)胞自噬過度激活且起到神經(jīng)保護(hù)作用[19,20]；β-石竹烯相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)β-石竹烯對腦缺血再灌注過程中的細(xì)胞自噬具有激活作用[5]，提示β-石竹烯可能通過激活自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究則在心肌缺血再灌注損傷過程中觀察了β-石竹烯對自噬的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：β-石竹烯干預(yù)能夠使缺血心肌中自噬小體增多、自噬標(biāo)志基因Beclin-1及LC3-II/LC3-I的表達(dá)增加，表明β-石竹烯能夠在心肌缺血再灌注過程中激活自噬，這也可能是β-石竹烯發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。為驗證這一機(jī)制，本研究進(jìn)行了β-石竹烯及3-MA聯(lián)合干預(yù)，發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3-MA削弱了β-石竹烯的心肌保護(hù)作用，β-石竹烯聯(lián)合3-MA干預(yù)后小鼠心電圖ST段、血清中LDH及CK-MB的含量高于單用β-石竹烯，心肌梗死面積及心肌病理改變也較單用β-石竹烯加重，結(jié)果表明β-石竹烯減輕心肌缺血再灌注損傷的作用與激活自噬有關(guān)。

綜上所述，β-石竹烯能夠減輕小鼠心肌再灌注損傷，激活自噬是可能的分子機(jī)制。為使用β-石竹烯進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷的防治提供了實驗依據(jù)，也為闡明自噬在心肌缺血再灌注損傷中的作用、發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷新的防治靶點提供了思路。