蘇偉，肖暖，楊金鳳

急性心肌梗死（AMI）是由冠狀動脈（冠脈）斑塊破裂或血管痙攣引起的冠脈血管急性、持續(xù)性閉塞而使心肌組織缺血缺氧導致，是世界范圍內主要因病死亡原因，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前經皮冠脈介入治療（PCI）被認為是治療AMI最安全有效的恢復再灌注的手段，但PCI術后冠脈無復流情況時有發(fā)生，發(fā)生率約5%～25%[2,3]，給患者預后及生活質量帶來了嚴重影響。尋找有效生物學指標早期診斷、早期預防及治療AMI患者PCI術后冠脈無復流的發(fā)生，仍是臨床研究熱點。目前PCI術后冠脈無復流發(fā)生機制尚未明確，研究發(fā)現，無復流與心肌細胞微血管痙攣、血管內皮細胞損傷及血管炎性反應有關[4]。微小RNA（miRNA）是一類含多個核苷酸的內源性非編碼小RNA，其通過抑調控靶基因的表達參與疾病的病理過程[5]。miR-155是miRNAs家族一員，在多種炎癥疾?。ㄈ珙愶L濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化等）中表達上調[6]。朱江等[7]研究發(fā)現，AMI后心力衰竭（心衰）患者血清miR-155水平顯著高于健康對照組，且提示其與血管內皮損傷有關。程序性細胞死亡因子4（PDCD4）是新確定的一種抑癌基因，在炎癥疾病中作用尚不明確，有研究報道，PDCD4缺失可減少小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質沉積，進而減少動脈粥樣硬化斑塊形成[8]。目前有關miR-155、PDCD4在動脈粥樣硬化中的水平研究較多，而有關二者與AMI患者PCI術后冠脈無復流的關系研究鮮有報道，因此本研究分析循環(huán)miR-155、PDCD4水平與急性心肌梗死患者PCI術后冠脈無復流的關系，以期為臨床探尋早期診斷、預防及治療AMI患者PCI術后冠脈無復流發(fā)生的可靠生物學靶標提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2018年8月～2020年9月于河北大學附屬醫(yī)院急診科診斷為AMI行急診PCI的患者477例為研究對象，其中男性248例，女性229例，年齡40～80歲，平均年齡（60.00±9.85）歲?；颊呔凑?012年《經皮冠狀動脈介入治療指南（簡本）》[9]行PCI治療（胸痛發(fā)作12 h內），術后12 h內按造影結果，參照心肌梗死溶栓治療臨床試驗（TIMI）血流分級[10]，分為無復流組86例（0級＜TIMI≤2級），再灌注組391例（2級＜TIMI≤3級）。入選標準：①符合2015《急性心肌梗死診斷和治療指南》[11]修訂版中AMI相關診斷標準；②發(fā)病12 h內行急診PCI治療者；③持續(xù)胸痛＞30 min；④臨床基線數據完整者；⑤自愿參與并配合研究者。排除標準：①手術禁忌癥患者；②合并嚴重感染、免疫系統(tǒng)疾病、嚴重肝臟及腎功能不全、惡性腫瘤者；③急腹癥、夾層動脈瘤等患者；④妊娠、哺乳期患者。本研究經我院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol試劑（貨號：S30876）、逆轉錄試劑盒（貨號：NGB-54415）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（貨號：638315）購自上海北諾生物科技有限公司；miR-155、PDCD4及內參U6、GADPH引物由上海生工生物工程有限公司合成；紫外分光光度計（型號：NanoDrop One-w）購自北京智杰方遠科技有限公司，qRT-PCR分析儀（型號：SLAN-96P）購自購自日本Olympus公司。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集患者的一般資料，包括性別、年齡、體質指數（BMI）、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、卒中史等；臨床血常規(guī)基線資料，主要包括白細胞值（WBC）、中性粒細胞值（N）、淋巴細胞值（L）、中性粒細胞/淋巴細胞比值（N/L）；入院次日晨起空腹檢測生化指標，主要包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GGT）、白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、前白蛋白（PA）。

1.3.2 樣品采集采集患者術后8 h外周靜脈血5 ml于肝素抗凝管中，離心5 min（3000 r/min，離心半徑8 cm），分離得到血漿，于-80 ℃冰箱待用。

1.3.3 qRT-PCR法測定血漿miR-155、PDCD4 mRNA表達水平從-80℃冰箱中取出血漿樣本，按照RNA試劑盒說明書提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA。參照實時熒光定量PCR試劑盒說明進行實時熒光定量PCR反應，所用引物序列見表1。反應體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應程序：95℃預處理20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。以U6、GADPH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算受試者血漿miR-155、PDCD4 mRNA相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，計量資料以平均值±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數及百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson法分析血漿miR-155與PDCD4水平相關性；以AMI患者PCI術后是否發(fā)生冠脈無復流為因變量，以單因素分析具有統(tǒng)計學意義因素為自變量進行多因素Logistic回歸分析，回歸方法采用進入法，效應值用OR值及其95%CI值；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血漿miR-155、PDCD4水平對AMI患者PCI術后冠脈無復流的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較兩組患者在年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、糖尿病、卒中基線資料及L、TG、TC、HDL、ALB、UA、PA等實驗室指標比較中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；無復流組患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比較中明顯高于再灌注組患者（P＜0.05），表2。

2.2 無復流組與再灌注組患者血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比較與再灌注組患者比較，無復流組患者血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平均明顯升高（P＜0.05），表3。

表3 無復流組與再灌注組患者循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比較

2.3 pearson法分析血漿miR-155、PDCD4水平相關性分析如圖1所示，生物信息學預測（miRanda網站）顯示，miR-155、PDCD4存在結合位點。pearson相關性分析結果顯示，AMI患者血漿miR-155與PDCD4 mRNA水平呈正相關（r=0.561，P＜0.05），圖2。

圖1 血漿miR-155、PDCD4預測結合位點

圖2 血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平相關性分析

2.4 多因素Logistic回歸分析AMI患者PCI術后冠脈無復流的影響因素以AMI患者PCI術后是否發(fā)生冠脈無復流為因變量，排除性別、年齡等混雜因素后，以WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT、循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平等上述差異有統(tǒng)計學意義的因素為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，循環(huán)miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表達是AMI患者PCI術后發(fā)生冠脈無復流的獨立危險因素（P＜0.05），表4。

表4 AMI患者PCI術后冠脈無復流的影響因素分析

2.5 循環(huán)miR-155、PDCD4水平對AMI患者PCI術后冠脈無復流的診斷價值分析循環(huán)miR-155水平診斷急性心肌梗死患者PCI術后冠脈無復流AUC為0.812（95%CI：0.756～0.863），截斷值為2.91，其靈敏度、特異度分別為66.9%、79.1%；PDCD4 mRNA診斷急性心肌梗死患者PCI術后冠脈無復流的AUC為0.866（95%CI：0.756～0.863），截斷值為0.75，其靈敏度、特異度分別為77.6%、87.9%；兩者聯合診斷的AUC為0.937（95%CI：0.901～0.936），其靈敏度、特異度分別為83.5%、89.7%（圖3）。

圖3 循環(huán)miR-155、PDCD4水平診斷AMI患者PCI術后冠脈無復流的ROC曲線

3 討論

隨著社會發(fā)展、現代生活節(jié)奏加快、人們生活水平提高及飲食習慣的改變，我國AMI發(fā)病率呈逐年升高趨勢，AMI是臨床常見急危重癥，在發(fā)達國家被稱為“頭號殺手”[12,13]。急診PCI手術是治療AMI主要手段之一，PCI技術的成熟與改進使得AMI患者遠期預后及生存率均有較大改善，但術后約5%～25%患者發(fā)生冠脈無復流現象，其是由冠脈閉塞導致血氧供應中斷，經手術重建血運時，梗死部位心肌組織無法出現血液灌注的情況，嚴重影響患者院內不良事件及近遠期預后[14,15]。但目前臨床仍缺乏對PCI術后冠脈無復流早期準確診斷疾病病情評估的可靠生物學指標。本研究分析循環(huán)miR-155、PDCD4水平與AMI患者PCI術后冠脈無復流的關系，以期為尋找早期診斷PCI術后冠脈無復流發(fā)生的可靠生物標志物，及早干預改善預后提供一定借鑒。

本研究首先比較患者一般資料，結果顯示無復流組患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比較中明顯高于再灌注組患者。γ-GGT屬于氧化應激標志物[16]，因此一般資料表明與再灌注良好者比較，冠脈無復流患者入院時炎癥狀態(tài)，應激反應等均處于更高水平，機體受到更強打擊。研究證實，巨噬細胞中過量脂質沉積導致巨噬細胞泡沫化，進一步促進動脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，且由巨噬細胞介導的血管內皮細胞損傷及炎性反應與心肌無復流關系密切[17]。miR-155是典型的多功能miRNA，位于人類21號染色體，大量研究表明其在細胞分化、免疫、血管炎癥反應等方面發(fā)揮作用，可促進巨噬細胞對脂質的攝取，導致巨噬細胞脂質沉積[18]。有研究報道，抑制miR-155表達水平可減弱心肌梗死巨噬細胞極化和依賴于SOCS1/NF-κB途徑的炎癥反應，從而減弱心肌梗死引起的交感神經重塑和室性心律失常[19]。本研究結果顯示，無復流組患者血漿miR-155/U6水平明顯高于再灌注組患者。與既往研究結果一致，提示miR-155異常高表達與AMI患者PCI術后冠脈無復流的發(fā)生有關。

PDCD4是一種抑癌基因，也是一種由巨噬細胞分泌的典型炎性介質，可激活Toll樣受體4（TLR4）信號通路，促進巨噬細胞脂質沉積，從而促進動脈粥樣硬化斑塊形成[20]。肖靜等[21]研究發(fā)現，抑制心臟干細胞PDCD4表達水平可明顯減少心肌細胞凋亡，為臨床治療心肌梗死提供新方向。本研究結果顯示，無復流組患者血漿PDCD4水平明顯高于再灌注組患者。與肖靜等研究結果趨勢一致，提示血漿PDCD4異常高表達可能與AMI患者PCI術后冠脈無復流發(fā)生關系密切。有學者在動物實驗研究中發(fā)現，miR-155可通過正性調控其靶基因PDCD4，從而過度激活血管炎癥反應，加重冠脈粥樣硬化性病變[22]。本研究生物信息學預測（miRanda網站）顯示，miR-155、PDCD4存在結合位點且AMI患者血漿miR-155/U6與PDCD4 mRNA水平呈正相關。提示血漿miR-155、PDCD4可能發(fā)揮正向調控作用共同參與AMI患者PCI術后冠脈無復流發(fā)生，在重建血運時，心肌梗死部位心肌組織無法出現血液灌注的具體機制有待進一步深入研究。本研究進一步分析顯示，血漿miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表達均是AMI患者PCI術后發(fā)生冠脈無復流的獨立危險因素，提示miR-155、PDCD4高表達AMI患者發(fā)生PCI術后冠脈無復流風險較大，對此類患者在治療和術后恢復中應給予更多關注?；谘獫{miR-155、PDCD4在PCI術后發(fā)生冠脈無復流患者中異常高表達，推測二者對PCI術后發(fā)生冠脈無復流有一定診斷價值，進一步ROC分析結果顯示，miR-155、PDCD4診斷AMI患者PCI術后冠脈無復流的AUC分別為0.812、0.866，兩者聯合診斷的AUC為0.937。說明miR-155、PDCD4聯合檢測對AMI患者PCI術后冠脈無復流有較高診斷價值，可為臨床提供一定參考。

綜上所述，血漿miR-155、PDCD4水平異常高表達可能與AMI患者PCI術后冠脈無復流發(fā)生有關，二者聯合檢測對AMI患者PCI術后冠脈無復流有較高診斷效能，可為臨床早期評估患者PCI術后冠脈無復流并采取及早采取措施進行改善有一定意義。而本研究并未對血漿miR-155、PDCD4與PCI術后冠脈無復流發(fā)生的具體作用機制進行探討，后期應進行深入闡述。