薛慶海

無(wú)錫市食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心 (無(wú)錫 214028)

硝基咪唑類藥物(nitroimidazoles，NMZs)是一類具有硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，被廣泛用于治療動(dòng)物的厭氧細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染，同時(shí)也是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，能夠促進(jìn)禽畜的生長(zhǎng)及改善飼料轉(zhuǎn)換率[1,2]。研究表明該類化合物具有潛在的細(xì)胞誘變性、致畸致癌性等危害，且在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物仍具有毒理作用[3-5]，因此已被美國(guó)和歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家禁用。我國(guó)也對(duì)硝基咪唑類獸藥進(jìn)行了嚴(yán)格限制，GB 31650—2019[6]僅允許甲硝唑、地美硝唑作為治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出。

目前，硝基咪唑類藥物的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法[7]、液相色譜法[8,9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2-4,11-14]。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)成本較低，適用于批量快速篩查，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性；液相色譜法的靈敏度較低，容易被雜質(zhì)干擾，無(wú)法準(zhǔn)確定性；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品前處理需要衍生化，所需時(shí)間長(zhǎng)，操作較復(fù)雜；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、選擇性好，目前在硝基咪唑類的檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15-17]也采用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。GB/T 21318—2007、SN/T 1928—2007標(biāo)準(zhǔn)前處理步驟較多，而且用到GPC凈化，試劑消耗多且不能批量前處理；SN/T 2624—2010標(biāo)準(zhǔn)不僅適用于硝基咪唑類的檢測(cè)，還適用于磺胺類、三苯甲烷類等多種堿性藥物殘留的檢測(cè)，所以前處理相對(duì)復(fù)雜。本研究建立了一種QuEChERS提取凈化、C18固相萃取柱進(jìn)一步凈化，UPLC- MS/MS法檢測(cè)豬肉中5種硝基咪唑殘留量的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、回收率高、精密度高，可用于豬肉中5種硝基咪唑殘留量的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品，購(gòu)于無(wú)錫市各超市；甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、洛硝噠唑(Ronidazole，RNZ)、地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)、羥基甲硝唑(MNZOH)、羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.5%)，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸，色譜純，德國(guó)默克公司；微孔濾膜(有機(jī)系)，0.22 μm，上海安譜；QuEChERS萃取鹽包(含4 g無(wú)水硫酸鈉、1 g氯化鈉)，美國(guó)安捷倫公司、C18固相萃取柱(1.0 g，6 mL)，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500型超高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)，美國(guó)SCIEX公司；C18色譜柱，美國(guó)安捷倫公司；Vortex 3型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；Milli-Q IQ7000型超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝公司；X1R型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；固相萃取裝置，上海安譜公司；AutoEVA-20Pus型氮吹儀，廈門?？乒荆籑E204E型分析天平，瑞士梅特勒公司；XS205DU型分析天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1溶液配制

0.1%甲酸水溶液：吸取1.0 mL甲酸，加超純水混勻并定容至1 000 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.1 mg) 每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為1 mg/mL，貯存于棕色標(biāo)液瓶中，-20 ℃冰箱中保存。分別吸取每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，貯存于棕色標(biāo)液瓶中，0 ℃～4 ℃冰箱中保存。使用時(shí)根據(jù)需要用空白基質(zhì)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2樣品前處理

稱取5.0 g(精確至0.01g)經(jīng)攪碎、混勻的樣品至50 mL離心管中，加入3 mL水，渦旋混勻，加入10 mL乙腈和QuEChERS萃取鹽包，渦旋振蕩10 min；在4 ℃下以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下低溫離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，待進(jìn)一步凈化；將上清液全部?jī)A入用5 mL甲醇預(yù)淋洗過(guò)的C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液于試管中，用氮吹儀在40 ℃條件下吹至近干，殘?jiān)贸跏剂鲃?dòng)相溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱，Agilent ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相，A為0.1%甲酸水，B為甲醇；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1～3 min，5%～95%B；3～4 min，95%B；4～4.2 min，95%～5%B；4.2～6 min，5%B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式，正離子掃描；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；輔助氣壓力35 psi；離子源溫度550 ℃；碰撞氣為氮?dú)?；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種硝基咪唑的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

考慮到乙腈對(duì)大多數(shù)獸藥殘留的提取效果較好、通過(guò)鹽析較容易實(shí)現(xiàn)與水相的分離[18]，因此選用乙腈作為硝基咪唑類藥物的提取劑。豬肉樣品(加標(biāo)1.0 μg/kg)中的硝基咪唑類藥物經(jīng)過(guò)乙腈提取，QuEChERS萃取鹽包凈化后，經(jīng)過(guò)UPLC-MSMS分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾比較大，考慮使用固相萃取柱進(jìn)一步凈化。選用了C18、MCX、SCX 3種固相萃取柱對(duì)QuEChERS提取液凈化，發(fā)現(xiàn)凈化后，硝基咪唑類藥物的回收率均在85%以上，回收效果良好?？紤]到使用C18固相萃取柱凈化只需要用到甲醇一種溶劑，而MCX、SCX柱則要使用多種溶液，所以選用C18柱進(jìn)行凈化。

2.2 定溶液的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用甲醇直接定容進(jìn)樣，多個(gè)化合物產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，色譜峰寬大畸形，甚至分叉；而采用初始流動(dòng)相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容時(shí)，可獲得尖銳對(duì)稱的色譜峰，并且化合物靈敏度較高。所以，選擇初始流動(dòng)相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將5種硝基咪唑類混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用空白基質(zhì)溶液稀釋成1 μg/mL的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，使用針泵進(jìn)樣，直接進(jìn)質(zhì)譜。在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定各硝基咪唑類的分子離子，將分子離子作為母離子；給予一定的碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，進(jìn)一步對(duì)碰撞能量和去簇電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取響應(yīng)高且干擾小的兩個(gè)子離子作為定量定性離子，響應(yīng)最高的作為定量離子，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 線性范圍、回歸方程和定量限

在選定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下，5種硝基咪唑類藥物出峰良好，其典型的MRM譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 5種硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的典型MRM圖

稱取6份空白樣品，按照1.3.2的前處理方法處理， 得到空白基質(zhì)溶液，配制濃度為1、10、50、100、200、500 μg/L的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。以待測(cè)物定量離子的峰面積y對(duì)其濃度x(μg/L)得到5種硝基咪唑的線性回歸方程，其線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。以信噪比為10(S/N=10)計(jì)算5種硝基咪唑的定量限，見(jiàn)表2。

表2 5種硝基咪唑的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限

2.5 方法回收率和精密度

MNZOH在0.6、1.2、6.0 μg/kg 3個(gè)水平，其余4種硝基咪唑分別在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平設(shè)置6個(gè)平行樣，并計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：在豬肉樣品中，5種硝基咪唑的平均加標(biāo)回收率在79.6%～103.2%之間，各平行樣間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～9.1%之間，平行性較好。

表2 5種硝基咪唑的回收率及精密度

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)無(wú)錫市各超市采購(gòu)的20批次豬肉(前腿肉、后腿肉等)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均為未檢出，說(shuō)明生豬養(yǎng)殖企業(yè)能夠較好的執(zhí)行相關(guān)國(guó)家規(guī)定，嚴(yán)格控制硝基咪唑類藥物的使用。

3 結(jié)論

本研究建立了乙腈提取、QuEChERS凈化、C18固相萃取柱進(jìn)一步凈化，UPLC-MSMS法測(cè)定豬肉中5種硝基咪唑殘留量的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、快捷，回收率高，重復(fù)性好，靈敏度高，適合豬肉中5種硝基咪唑殘留量的檢測(cè)。