秦鐵城，杜潤爽，宋雪飛

膠質(zhì)瘤是一種腦部常見的惡性腫瘤，具有侵襲性強和術后復發(fā)率、死亡率高等特點；盡管近年來膠質(zhì)瘤在治療方面取得了很大進步，但其預后效果仍不太理想。因此，深入了解膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的有效的治療策略十分必要。RNA 解螺旋酶DDX5（DEAD-box helicase 5）是一種生物學功能多樣的核蛋白，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、凋亡和核糖體生物合成等過程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，DDX5 在乳腺癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤中異常高表達，且可通過調(diào)控細胞生物學行為參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。近年來，有研究指出，DDX5 在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，其表達水平與腫瘤大小、腫瘤分級和顱內(nèi)轉移等密切相關，且具有促進腫瘤細胞增殖和轉移的作用，但其對細胞周期和凋亡的影響并不清楚。因此，本研究于2018年3月至2019年4月通過下調(diào)DDX5表達探索對膠質(zhì)瘤SHG44 細胞周期和凋亡的影響及可能機制，旨在進一步揭示DDX5 在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的作用，為膠質(zhì)瘤的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人膠質(zhì)瘤細胞系SHG44( 中科院上海細胞庫), 改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)(美國Biological Industries),胎牛血清(杭州四季青),青鏈霉素混合液(北京索萊寶),0.25% 胰蛋白酶(美國Gibco),辣根酶標記的山羊抗鼠或兔IgG 抗體(北京中杉金橋),靶向DDX5 的小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)(正向引物5'-GCAAGUAGCUGCUGAAUAUUU-3'/反向引物5'-AUAUUCAGCAGCUACUUGCUU-3')及其陰性對照(NC)siRNA( 正向引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'/反向引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3')(上海吉瑪)。兔抗人β 肌動蛋白(β-actin)、β-連環(huán)素單克隆抗體和鼠抗人細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、存活蛋白單克隆抗體(美國Santa Cruz),兔抗人c-Myc、DDX5 單克隆抗體(美國Abcam),轉染試劑脂質(zhì)體(Lipofectamine)?3000 和Trizol 試劑(美國Invitrogen),逆轉錄試劑盒(北京Transgen),二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒(上海碧云天生物技術研究所),恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、酶標儀和分光光度計(美國Thermo Forma),倒置顯微鏡(日本Olympus),凝膠成像系統(tǒng)和聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國Bio-Rad)。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組與轉染

采用含10% 胎牛血清和100 U/mL青鏈霉混合液的DMEM 培養(yǎng)基在5%二氧化碳、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)SHG44 細胞。將對數(shù)生長期的SHG44細胞以10個/孔接種至6 孔板上后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為siRNA-NC 組（轉染NC siRNA）和siRNA-DDX5 組（轉染靶向DDX5的siRNA），每組設置3個復孔。待細胞匯合度達75% 左右時，參照Lipofectamine ?3000 說明書步驟根據(jù)實驗分組將50 nmol/L 靶向DDX5 的siRNA 和陰性對照siRNA 轉染至SHG44 細胞中。轉染6 h 后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48 h 后收集各組細胞，采用實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測各組細胞中DDX5 mRNA 和蛋白的表達水平以評價轉染效果。

1.3 實時熒光定量PCR 檢測DDX5 mRNA 的表達

采用Trizol 一步法提取SHG44 細胞總RNA，并采用分光光度計檢測RNA 的濃度與完整性。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 進行逆轉錄合成單鏈互補DNA（cDNA）。以cDNA 為模板，根據(jù)上海生工生物合成的PCR 引物（DDX5 正向5’-CACATCAATCATCAGCCATTCCT-3’，反向5’-CAAACAAATAGGCCCATCGC-3’；β -actin 正向5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，反向5’-CTCCTTAATGTCACGCACG -ATTTC-3’），按照PCR 擴增條件（94 ℃預變性180 s；94 ℃變性20 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，38個循環(huán)）進行擴增，以β-actin 為內(nèi)參，2法檢測各組SHG44細胞中DDX5 mRNA 的表達水平。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡

（1）細胞周期檢測：收集轉染后的各組SHG44 細胞于離心管中，1000 r/min 離心5 min 后棄上清，加入預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細胞，離心洗滌細胞3次。加入預冷的70% 乙醇4 ℃下固定24 h 后，再次以預冷的PBS 洗滌細胞2 次。吸去PBS 后，加入2 μL RNA 酶和200 μL 的PBS；37 ℃下孵育30 min 后，加入0.5 mL 50 mg/L的碘化丙啶（PI）；室溫下避光染色30 min 后，上流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況。實驗設置3個復孔，重復3 次。（2）細胞凋亡檢測：收集轉染后的各組SHG44 細胞后，調(diào)整細胞濃度為10個/毫升。取100 μL 細胞懸液于離心管中，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL PI 充分混勻后，室溫避光下孵育反應15 min；補加400 μL 結合緩沖液后，于1 h 內(nèi)上流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡率。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測DDX5、

β-

連環(huán)素、c-Myc、cyclin D1 和存活蛋白的表達

收集轉染后的各組細胞后，加入細胞裂解液抽提各組細胞總蛋白。參照BCA 蛋白定量試劑盒說明書對所提蛋白樣品進行定量。將蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。將熱變性后的蛋白樣品按照每孔80 μg 上樣至12% SDS-PAGE 凝膠（參照SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒說明書制備）孔中行電泳分離；電泳結束后，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。以5% 脫脂奶粉封膜2 h 后，浸入一抗工作液（DDX51∶1000、β-連環(huán)素1∶500、c-Myc 1∶1000、cyclin D11∶800、存活蛋白1∶800和β-actin 1∶1000）中4 ℃下孵育過夜；次日，再以辣根酶標記的山羊抗鼠或兔IgG 抗體（1∶5000）室溫孵育2 h。經(jīng)化學發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影曝光后，以β-actin 為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各組細胞中DDX5、β-連環(huán)素、c-Myc、cyclin D1和存活蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 轉染后膠質(zhì)瘤SHG44 細胞中DDX5 表達下調(diào)

實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，與siRNA-NC 組比較，siRNA-DDX5 組細胞中DDX5 mRNA[（0.98±0.06）比（0.25±0.02），

t

=34.627，

P

＜0.001）］和蛋白[（0.68±0.05）比（0.23±0.03），

t

=23.152，

P

＜0.001）］的表達水平明顯降低，蛋白水平見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞中RNA解螺旋酶DDX5蛋白的表達情況

2.2 下調(diào)DDX5 表達可誘導膠質(zhì)瘤SHG44 細胞周期阻滯于S 期并促進膠質(zhì)瘤SHG44 細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示，與siRNA-NC 組比較，siRNA-DDX5 組細胞在G0/G1 期所占百分比明顯降低，而在S 期所占百分比明顯升高（

P

＜0.05），細胞凋亡率也明顯升高（

P

＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞周期分布情況/（%，±s）

2.3 下調(diào)DDX5 表達可抑制膠質(zhì)瘤SHG44 細胞中Wnt/

β-

連環(huán)素信號通路的活化

蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，與siRNA-NC 組比較，siRNA-DDX5 組細胞中Wnt/β-連環(huán)素信號通路關鍵因子β-連環(huán)素及其下游相關蛋白c-Myc、cyclin D1 和存活蛋白的表達水平均明顯降低（

P

＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組β-連環(huán)素、c-Myc、cyclin D1和存活蛋白的表達水平

表2 各組細胞中β-連環(huán)素、c-Myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和存活蛋白表達水平的比較/±s

3 討論

DEAD 盒蛋白家族是一類廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的進化上高度保守的ATP 依賴性RNA 解旋酶，在RNA 代謝過程中發(fā)揮著重要作用；DDX5 是該家族中的重要成員，又名RNA解螺旋酶p68，其蛋白分子量為6.9×10Da，它的調(diào)控基因定位于17q21 染色體上；隨著研究的不斷深入，DDX5 除了參與核糖體生物合成外，還在細胞增殖、凋亡和信號通路調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著密切關系。在肝癌中DDX5 呈現(xiàn)高表達，且其表達水平的改變與腫瘤大小、分級、分化程度和預后不良等密切相關；同時，敲除DDX5表達可通過調(diào)控蛋白激酶B 信號通路抑制腫瘤細胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化。在胃癌中，DDX5 過表達可減弱長鏈非編碼RNA 心肌梗死相關轉錄本（MIAT）沉默對癌細胞增殖的抑制作用，可恢復轉染MIAT 特異性siRNA 引起的癌細胞S 期阻滯，并消除MIAT表達下調(diào)時引起的細胞凋亡。

本研究成功下調(diào)DDX5 表達后發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤SHG44 細胞在G0/G1 期的百分比明顯降低，而在S期的百分比明顯升高，下調(diào)DDX5 表達可誘導膠質(zhì)瘤SHG44 細胞周期阻滯于S 期。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DDX5 下調(diào)后SHG44 細胞凋亡率明顯升高。結果表明，下調(diào)DDX5 表達可誘導膠質(zhì)瘤SHG44 細胞周期阻滯并促進細胞凋亡。這提示，DDX5 可通過調(diào)控細胞周期和凋亡參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

Wnt/β-連環(huán)素信號通路是細胞內(nèi)經(jīng)典的Wnt通路，β-連環(huán)素是該通路的關鍵因子，其在細胞質(zhì)中過量聚集可進入細胞核，啟動下游相關基因的轉錄，參與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。DDX5 可通過激活Wnt/β-連環(huán)素信號逆轉lncRNA NEAT1 誘導的細胞周期阻滯和凋亡；而靶向抑制DDX5 表達可通過抑制Wnt/β-連環(huán)素信號通路相關蛋白β-連環(huán)素，c-Myc 和cyclin D1 的表達抑制該通路活化發(fā)揮抑制食管癌細胞增殖和侵襲的作用。在前列腺癌中，DDX5 缺失通過抑制哺乳動物雷帕霉素復合物1（mTORC1）信號傳導途徑引起癌細胞凋亡；mTORC1 抑制劑雷帕霉素可通過下調(diào)存活蛋白來增強多西紫杉醇對去勢耐藥前列腺癌PC-3 異種移植模型的療效。c-Myc 是一種重要的原癌基因，在促進腫瘤生長和血管生成等過程中發(fā)揮著重要作用；cyclin D1是一種細胞周期G1期的細胞周期素，同時也是一種重要的原癌基因，在細胞惡性增殖過程中發(fā)揮著重要作用；存活蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，具有很強的抗凋亡作用；三者均是Wnt/β-連環(huán)素信號通路下游相關因子，在膠質(zhì)瘤細胞周期和凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究采用蛋白質(zhì)印跡法進一步檢測發(fā)現(xiàn)，DDX5下調(diào)后膠質(zhì)瘤SHG44 細胞中β-連環(huán)素，c-Myc、cyclin D1 和存活蛋白的表達水平明顯降低。結果表明，下調(diào)DDX5 表達可抑制Wnt/β-連環(huán)素信號通路的活化。提示，下調(diào)DDX5 表達可能通過抑制Wnt/β-連環(huán)素信號通路的活化影響下游c-Myc、cyclin D1和存活蛋白的表達進而誘導膠質(zhì)瘤細胞周期阻滯和凋亡。

綜上所述，下調(diào)DDX5 表達可誘導膠質(zhì)瘤SHG44 細胞周期阻滯和凋亡，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活化有關。該結果初步揭示了DDX5 在膠質(zhì)瘤細胞周期和凋亡中的作用，為DDX5 有望成為膠質(zhì)瘤治療的基因靶點提供了新的參考依據(jù)。