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        黃芪多糖對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞活化的影響及作用機(jī)制

        2021-12-15 09:06:10朱云峰覃艷曹萌翟倩倩李燕王濤
        安徽醫(yī)藥 2021年12期
        關(guān)鍵詞:水平

        朱云峰,覃艷,曹萌,翟倩倩,李燕,王濤

        近年來(lái),由于人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,2 型糖尿病和肥胖病人逐年增加,嚴(yán)重威脅人民生命健康。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2 型糖尿病的重要原因。脂肪組織是發(fā)生IR 的場(chǎng)所之一,多種脂源性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、瘦素、抵抗素等參與或調(diào)節(jié)IR。巨噬細(xì)胞(adipose tissue macrophages,ATMs)數(shù)量增多,會(huì)導(dǎo)致促炎表達(dá)型巨噬細(xì)胞增多。ATMs 游走到脂肪組織后,致使刺激物增加經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage,M1)的招募作用,加重脂肪細(xì)胞的功能障礙,誘發(fā)IR。目前,ATMs已經(jīng)成為治療IR的新靶點(diǎn)。

        黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分之一,具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化等功效。研究發(fā)現(xiàn),APS 具有胰島素增敏作用,且無(wú)明顯的毒副作用,APS 干預(yù)能提高肥胖大鼠的葡萄糖輸注率。目前,APS 對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞活化的影響還未知。本研究于2018年11月至2019年5月主要探討了APS 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的影響及可能的作用機(jī)制,以期為APS用于改善IR提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

        脂肪細(xì)胞株3T3-L1及ANA-1 巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;APS:含量90%,美國(guó)泛華公司,1000 毫克/支;胎牛血清:美國(guó)HyClone 公司;小鼠IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒、小鼠TNFα ELISA 試劑盒:上海滬峰生物科技有限公司;PCR試劑盒:日本Takara 公司、大連寶生物有限公司;互補(bǔ)DNA(cDNA)第一鏈合成試劑盒:美國(guó)Fermentas公司;引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì),上海生工科技有限公司合成。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1

        前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞 將3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),用含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%~90%,加含終濃度0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、1 μmol/L 地塞米松和終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 胎牛血清高糖DMEM 培養(yǎng)48 h。48 h 后換含終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 小牛血清高糖DMEM 再培養(yǎng)48 h。48 h后再換含10% 胎牛血清的高糖DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2天更換一次含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化8~12 d,90% 的3T3-L1 細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞,用油紅O鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2

        巨噬細(xì)胞培養(yǎng) ANA-1 巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后,用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% 二氧化碳、97% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,每2~3 天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80% 左右時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)或取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.3

        共培養(yǎng)體系的建立 通過(guò)Transwell 共培養(yǎng)方式,將巨噬細(xì)胞種于上室,脂肪細(xì)胞種于下室。小室底部濾膜孔徑0.4 μm,細(xì)胞不能自由通過(guò),但兩層間的培養(yǎng)液及細(xì)胞因子可以自由通過(guò)。實(shí)驗(yàn)分為三組,空白對(duì)照組(NC):常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng),不進(jìn)行干預(yù);TNF-α 誘導(dǎo)干預(yù)組(TNF-α 組):含10 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)基干預(yù)24 h;APS 干預(yù)組(APS+TNF-α 組):含10 μg/L TNF-α 與0.10 g/L APS 的培養(yǎng)基共同干預(yù)24 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.4

        雙抗體夾心ELISA 測(cè)定IL-6、MCP-1 水平細(xì)胞培養(yǎng)上清液3500 r/min 離心10 min,取上清,分別參照IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其水平。

        1.2.5

        實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)檢測(cè)誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α 的mRNA水平Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,微量核酸儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 引物序列:iNOS 正向5'-GTTCACCCAGTTGTGCATCG-3',反向5'-ACTTGCGATGCTCCATGGTC-3'; TNF- α 正向5'-TCTCAAAACTCG AGTGACAAG-3',反向5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3';β 肌動(dòng)蛋白(β-actin)正向5'-CCTTCCTTCTTGGGTATGG -3',反向5'-TGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3'。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2法計(jì)算iNOS和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

        1.2.6

        蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白,100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后,以每孔30 μg 蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后,濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5% 脫脂牛奶中封閉1 h 后,分別加入一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗膜后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶200),室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后,加入ELC 顯影液,避光顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

        1.2.7

        巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 采用Transwell 共培養(yǎng)方式,小室濾膜孔徑8 μm 。將巨噬細(xì)胞種于上室,將脂肪細(xì)胞種于下室。實(shí)驗(yàn)分組與“1.2.3”相同。培養(yǎng)結(jié)束后,取出小室,吸棄培養(yǎng)基,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2 次。用棉簽擦去小室表面為遷移的細(xì)胞,加入4% 多聚甲醛固定30 min。PBS 清洗細(xì)胞2 次,加入0.4% 結(jié)晶紫染色15 min。PBS 清洗后,顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞染色情況,并拍照,對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果觀察

        前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程細(xì)胞形態(tài)如圖1;成熟脂肪細(xì)胞油紅O 染色結(jié)果如圖2,可見(jiàn)細(xì)胞體內(nèi)脂滴明顯,圍繞細(xì)胞核一周;巨噬細(xì)胞形態(tài)如圖3。

        圖1 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程細(xì)胞形態(tài)(×100):1A為誘導(dǎo)前;1B為誘導(dǎo)第4天;1C為誘導(dǎo)第8天;1D為誘導(dǎo)第12天 圖2 3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞油紅O染色圖:2A為×100;2B為×400 圖3 ANA-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)情況(×100)

        2.2 APS 抑制脂肪細(xì)胞因子IL-6、TNF

        、MCP-1的表達(dá)

        重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示,與12 h 比較,培養(yǎng)24 h、48 h 時(shí)TNF-α 組和APS+TNF-α 組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高。與24 h 比較,48 h 時(shí)NC 組、TNF-α 組和APS+TNF-α組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯降低。細(xì)胞培養(yǎng)相同時(shí)間,與NC 組比較,TNF-α 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高;與TNF-α 組比較,APS+TNF-α 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA水平均明顯降低。見(jiàn)表1。

        表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)上清液中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA表達(dá)水平比較/±s

        2.3 APS 抑制巨噬細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)

        與NC 組比較,TNF-α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著升高(

        P

        <0.05);與TNF- α 組比較,APS+TNF- α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著降低(

        P

        <0.05)。 見(jiàn)圖2、表2。

        表2 黃芪多糖(APS)對(duì)巨噬細(xì)胞誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響/±s

        圖2 黃芪多糖(APS)對(duì)巨噬細(xì)胞誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響:A為巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá);B為巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)

        2.4 APS 對(duì)脂肪細(xì)胞趨化巨噬細(xì)胞的影響

        NC組、TNF-α 組與APS+TNF-α 組趨化巨噬細(xì)胞數(shù)整體比較

        F

        =145.043,

        P

        <0.001。與NC 組(27.68 ± 4.25)個(gè)比較,TNF-α 組(88.34 ± 8.26)個(gè)顯著升高(

        P

        <0.05);與TNF- α 組比 較,APS+TNF- α 組(42.50 ±6.15)個(gè)顯著降低(

        P

        <0.05)。

        2.5 APS 激活巨噬細(xì)胞中AMPKα1/SIRT1 信號(hào)通路

        與NC 組比較,TNF-α 組磷酸化AMP 活化蛋白激酶α1(p-AMPKα1)和沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)蛋白水平顯著降低(

        P

        <0.05);與TNF-α組比較,APS+TNF-α 組p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白水平顯著升高(

        P

        <0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

        圖3 巨噬細(xì)胞AMPKα1/SIRT1信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

        表3 黃芪多糖(APS)對(duì)巨噬細(xì)胞中AMPKα1/SIRT1信號(hào)通路的影響/±s

        3 討論

        人脂肪體積增大可引起脂肪組織容積的增加,釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等細(xì)胞因子,進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向脂肪組織游走,并活化巨噬細(xì)胞?;罨木奘杉?xì)胞釋放更高水平的TNF-α、IL-6、IL-12等炎性細(xì)胞因子,這些炎性因子又以旁分泌或自分泌的方式使巨噬細(xì)胞與脂肪細(xì)胞相互作用,相互影響,調(diào)控炎癥反應(yīng)。TNF-α 是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子,多種組織和細(xì)胞均可分泌TNF-α。脂肪組織是內(nèi)源性TNF-α 的主要來(lái)源,主要由脂肪組織中的巨噬細(xì)胞分泌。MCP-1主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,巨噬細(xì)胞在MCP-1 的趨化作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,在TNF-α 誘導(dǎo)作用下,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α、MCP-1 表達(dá)水平明顯升高,提示在TNF-α誘導(dǎo)作用下,巨噬細(xì)胞或者,產(chǎn)生了較多炎性因子。而APS干預(yù)后,IL-6、TNF-α、MCP-1表達(dá)水平明顯降低,提示APS 可降低巨噬細(xì)胞的活化,抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。巨噬細(xì)胞游走到脂肪組織后,會(huì)加重脂肪細(xì)胞的功能障礙,產(chǎn)生IR。脂肪和脂肪間質(zhì)分泌的MCP-1 增多對(duì)巨噬細(xì)胞具有趨化作用。本研究顯示,在TNF-α 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)作用下,巨噬細(xì)胞趨化數(shù)明顯增加,而APS 的干預(yù)可降低巨噬細(xì)胞的趨化作用,提示APS可減輕IR。

        在炎性細(xì)胞因子如內(nèi)毒素、TNF-α 等刺激作用下,機(jī)體組織可表達(dá)iNOS,iNOS 通過(guò)催化合成大量一氧化氮。一氧化氮通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),促進(jìn)周邊細(xì)胞產(chǎn)生炎癥或細(xì)胞毒性,加重自身免疫組織的損傷。iNOS 是公認(rèn)的巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,TNF-α 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后,iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高,說(shuō)明TNFα誘導(dǎo)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化。APS作用后,TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)降低,進(jìn)一步說(shuō)明APS可抑制TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。

        AMP 活化蛋白激酶(AMPK)是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β 和γ 組成。AMP 活化蛋白激酶α(AMPKα)可通過(guò)對(duì)靶蛋白的磷酸化調(diào)節(jié),參與脂代謝。AMPK 活性的降低可導(dǎo)致血漿游離脂肪酸升高及脂質(zhì)在體內(nèi)的異位沉積,進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂性疾病的發(fā)生。SIRT1是一種NAD+依賴(lài)的組蛋白去乙?;?,可增加AMPKα 的活性。AMPKα/SIRT1 信號(hào)通路在脂肪組織脂代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用,激活A(yù)MPKα/SIRT1 信號(hào)通路可降低巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌。本研究結(jié)果顯示,TNF-α誘導(dǎo)后,巨噬細(xì)胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低,說(shuō)明細(xì)胞中AMPKα/SIRT1 信號(hào)通路受到抑制。APS 干預(yù)后,TNF-α 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達(dá)水平升高,表明APS 可激活細(xì)胞中AMPKα/SIRT1信號(hào)通路。

        綜上所述,APS 可降低脂肪組織巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及趨化作用,抑制巨噬細(xì)胞活化,其作用機(jī)制與激活細(xì)胞中AMPKα/SIRT1信號(hào)通路有關(guān)。

        (本文圖1~3見(jiàn)插圖12-1)

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