朱云峰，覃艷，曹萌，翟倩倩，李燕，王濤

近年來(lái)，由于人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，2 型糖尿病和肥胖病人逐年增加，嚴(yán)重威脅人民生命健康。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2 型糖尿病的重要原因。脂肪組織是發(fā)生IR 的場(chǎng)所之一，多種脂源性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、瘦素、抵抗素等參與或調(diào)節(jié)IR。巨噬細(xì)胞（adipose tissue macrophages，ATMs）數(shù)量增多，會(huì)導(dǎo)致促炎表達(dá)型巨噬細(xì)胞增多。ATMs 游走到脂肪組織后，致使刺激物增加經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（classically activated macrophage，M1）的招募作用，加重脂肪細(xì)胞的功能障礙，誘發(fā)IR。目前，ATMs已經(jīng)成為治療IR的新靶點(diǎn)。

黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分之一，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化等功效。研究發(fā)現(xiàn)，APS 具有胰島素增敏作用，且無(wú)明顯的毒副作用，APS 干預(yù)能提高肥胖大鼠的葡萄糖輸注率。目前，APS 對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞活化的影響還未知。本研究于2018年11月至2019年5月主要探討了APS 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的影響及可能的作用機(jī)制，以期為APS用于改善IR提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

脂肪細(xì)胞株3T3-L1及ANA-1 巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；APS：含量90%，美國(guó)泛華公司，1000 毫克/支；胎牛血清：美國(guó)HyClone 公司；小鼠IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、小鼠TNFα ELISA 試劑盒：上海滬峰生物科技有限公司；PCR試劑盒：日本Takara 公司、大連寶生物有限公司；互補(bǔ)DNA（cDNA）第一鏈合成試劑盒：美國(guó)Fermentas公司；引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)，上海生工科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1

前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞 將3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%，加含終濃度0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、1 μmol/L 地塞米松和終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 胎牛血清高糖DMEM 培養(yǎng)48 h。48 h 后換含終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 小牛血清高糖DMEM 再培養(yǎng)48 h。48 h后再換含10% 胎牛血清的高糖DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2天更換一次含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化8～12 d，90% 的3T3-L1 細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞，用油紅O鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2

巨噬細(xì)胞培養(yǎng) ANA-1 巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% 二氧化碳、97% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每2～3 天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80% 左右時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

共培養(yǎng)體系的建立 通過(guò)Transwell 共培養(yǎng)方式，將巨噬細(xì)胞種于上室，脂肪細(xì)胞種于下室。小室底部濾膜孔徑0.4 μm，細(xì)胞不能自由通過(guò)，但兩層間的培養(yǎng)液及細(xì)胞因子可以自由通過(guò)。實(shí)驗(yàn)分為三組，空白對(duì)照組（NC）：常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)；TNF-α 誘導(dǎo)干預(yù)組（TNF-α 組）：含10 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)基干預(yù)24 h；APS 干預(yù)組（APS+TNF-α 組）：含10 μg/L TNF-α 與0.10 g/L APS 的培養(yǎng)基共同干預(yù)24 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4

雙抗體夾心ELISA 測(cè)定IL-6、MCP-1 水平細(xì)胞培養(yǎng)上清液3500 r/min 離心10 min，取上清，分別參照IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其水平。

1.2.5

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和TNF-α 的mRNA水平Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 引物序列：iNOS 正向5'-GTTCACCCAGTTGTGCATCG-3'，反向5'-ACTTGCGATGCTCCATGGTC-3'； TNF- α 正向5'-TCTCAAAACTCG AGTGACAAG-3'，反向5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3'；β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）正向5'-CCTTCCTTCTTGGGTATGG -3'，反向5'-TGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3'。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2法計(jì)算iNOS和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg 蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。5% 脫脂牛奶中封閉1 h 后，分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶200），室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ELC 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.7

巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 采用Transwell 共培養(yǎng)方式，小室濾膜孔徑8 μm 。將巨噬細(xì)胞種于上室，將脂肪細(xì)胞種于下室。實(shí)驗(yàn)分組與“1.2.3”相同。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，吸棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 次。用棉簽擦去小室表面為遷移的細(xì)胞，加入4% 多聚甲醛固定30 min。PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入0.4% 結(jié)晶紫染色15 min。PBS 清洗后，顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞染色情況，并拍照，對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果觀察

前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程細(xì)胞形態(tài)如圖1；成熟脂肪細(xì)胞油紅O 染色結(jié)果如圖2，可見(jiàn)細(xì)胞體內(nèi)脂滴明顯，圍繞細(xì)胞核一周；巨噬細(xì)胞形態(tài)如圖3。

圖1 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程細(xì)胞形態(tài)（×100）：1A為誘導(dǎo)前；1B為誘導(dǎo)第4天；1C為誘導(dǎo)第8天；1D為誘導(dǎo)第12天 圖2 3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞油紅O染色圖：2A為×100；2B為×400 圖3 ANA-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)情況（×100）

2.2 APS 抑制脂肪細(xì)胞因子IL-6、TNF

-α

、MCP-1的表達(dá)

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，與12 h 比較，培養(yǎng)24 h、48 h 時(shí)TNF-α 組和APS+TNF-α 組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高。與24 h 比較，48 h 時(shí)NC 組、TNF-α 組和APS+TNF-α組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯降低。細(xì)胞培養(yǎng)相同時(shí)間，與NC 組比較，TNF-α 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高；與TNF-α 組比較，APS+TNF-α 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA水平均明顯降低。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)上清液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA表達(dá)水平比較/±s

2.3 APS 抑制巨噬細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)

與NC 組比較，TNF-α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）；與TNF- α 組比較，APS+TNF- α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）。 見(jiàn)圖2、表2。

表2 黃芪多糖（APS）對(duì)巨噬細(xì)胞誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的影響/±s

圖2 黃芪多糖（APS）對(duì)巨噬細(xì)胞誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的影響：A為巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)；B為巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)

2.4 APS 對(duì)脂肪細(xì)胞趨化巨噬細(xì)胞的影響

NC組、TNF-α 組與APS+TNF-α 組趨化巨噬細(xì)胞數(shù)整體比較

F

=145.043，

P

＜0.001。與NC 組（27.68 ± 4.25）個(gè)比較，TNF-α 組（88.34 ± 8.26）個(gè)顯著升高（

P

＜0.05）；與TNF- α 組比 較，APS+TNF- α 組（42.50 ±6.15）個(gè)顯著降低（

P

＜0.05）。

2.5 APS 激活巨噬細(xì)胞中AMPKα1/SIRT1 信號(hào)通路

與NC 組比較，TNF-α 組磷酸化AMP 活化蛋白激酶α1（p-AMPKα1）和沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）；與TNF-α組比較，APS+TNF-α 組p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 巨噬細(xì)胞AMPKα1/SIRT1信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

表3 黃芪多糖（APS）對(duì)巨噬細(xì)胞中AMPKα1/SIRT1信號(hào)通路的影響/±s

3 討論

人脂肪體積增大可引起脂肪組織容積的增加，釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向脂肪組織游走，并活化巨噬細(xì)胞?；罨木奘杉?xì)胞釋放更高水平的TNF-α、IL-6、IL-12等炎性細(xì)胞因子，這些炎性因子又以旁分泌或自分泌的方式使巨噬細(xì)胞與脂肪細(xì)胞相互作用，相互影響，調(diào)控炎癥反應(yīng)。TNF-α 是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子，多種組織和細(xì)胞均可分泌TNF-α。脂肪組織是內(nèi)源性TNF-α 的主要來(lái)源，主要由脂肪組織中的巨噬細(xì)胞分泌。MCP-1主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，巨噬細(xì)胞在MCP-1 的趨化作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在TNF-α 誘導(dǎo)作用下，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α、MCP-1 表達(dá)水平明顯升高，提示在TNF-α誘導(dǎo)作用下，巨噬細(xì)胞或者，產(chǎn)生了較多炎性因子。而APS干預(yù)后，IL-6、TNF-α、MCP-1表達(dá)水平明顯降低，提示APS 可降低巨噬細(xì)胞的活化，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。巨噬細(xì)胞游走到脂肪組織后，會(huì)加重脂肪細(xì)胞的功能障礙，產(chǎn)生IR。脂肪和脂肪間質(zhì)分泌的MCP-1 增多對(duì)巨噬細(xì)胞具有趨化作用。本研究顯示，在TNF-α 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)作用下，巨噬細(xì)胞趨化數(shù)明顯增加，而APS 的干預(yù)可降低巨噬細(xì)胞的趨化作用，提示APS可減輕IR。

在炎性細(xì)胞因子如內(nèi)毒素、TNF-α 等刺激作用下，機(jī)體組織可表達(dá)iNOS，iNOS 通過(guò)催化合成大量一氧化氮。一氧化氮通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)周邊細(xì)胞產(chǎn)生炎癥或細(xì)胞毒性，加重自身免疫組織的損傷。iNOS 是公認(rèn)的巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，TNF-α 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明TNFα誘導(dǎo)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化。APS作用后，TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步說(shuō)明APS可抑制TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。

AMP 活化蛋白激酶（AMPK）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β 和γ 組成。AMP 活化蛋白激酶α（AMPKα）可通過(guò)對(duì)靶蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)，參與脂代謝。AMPK 活性的降低可導(dǎo)致血漿游離脂肪酸升高及脂質(zhì)在體內(nèi)的異位沉積，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂性疾病的發(fā)生。SIRT1是一種NAD+依賴(lài)的組蛋白去乙?；?，可增加AMPKα 的活性。AMPKα/SIRT1 信號(hào)通路在脂肪組織脂代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用，激活A(yù)MPKα/SIRT1 信號(hào)通路可降低巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌。本研究結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明細(xì)胞中AMPKα/SIRT1 信號(hào)通路受到抑制。APS 干預(yù)后，TNF-α 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達(dá)水平升高，表明APS 可激活細(xì)胞中AMPKα/SIRT1信號(hào)通路。

綜上所述，APS 可降低脂肪組織巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及趨化作用，抑制巨噬細(xì)胞活化，其作用機(jī)制與激活細(xì)胞中AMPKα/SIRT1信號(hào)通路有關(guān)。

（本文圖1～3見(jiàn)插圖12-1）