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        微小RNA-335-3p靶向小鼠雙微體基因調(diào)控骨髓瘤細(xì)胞的增殖和凋亡

        2021-12-15 08:22:52于云祥龔泰芳劉小濤柯文李彬彬
        安徽醫(yī)藥 2021年12期
        關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染骨髓瘤熒光素酶

        于云祥,龔泰芳,劉小濤,柯文,李彬彬

        骨髓瘤是一種骨髓內(nèi)單克隆漿細(xì)胞異常增殖的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),極大威脅人類(lèi)生命健康。骨髓瘤的治療主要以藥物治療、造血干細(xì)胞移植術(shù)為主。目前,骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制尚未明確,臨床治療療效不佳。探討骨髓瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制并尋找該疾病的治療靶點(diǎn)具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼RNA,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有報(bào)道稱(chēng),miR-335-3p在多發(fā)性骨髓瘤病人外周血中表達(dá)下調(diào),外周血miR-335-3p 水平變化對(duì)骨髓瘤診斷具有重要意義。但是,miR-335-3p 對(duì)骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的影響及其作用機(jī)制還未知。本研究于2018年5月至2019年1月主要探討了miR-335-3p 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制,以期為骨髓瘤的治療提供新靶點(diǎn)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑

        骨髓瘤細(xì)胞KM3和U266細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Trizol試劑和Lipofectamine2000 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司;引物序列由上海生工生物技術(shù)公司提供;miR-335-3p 模擬物(miR-335-3p mimics)以及miRNA 陰性對(duì)照購(gòu)自廣州銳博生物有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;小鼠雙微體基因(MDM2)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A(P21)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2 相關(guān)X(Bax)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1

        細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇KM3 和U266 細(xì)胞,用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80% 左右時(shí),進(jìn)行傳代。正常骨髓細(xì)胞MNC 培養(yǎng):參照文獻(xiàn)[8]方法,采集正常供髓者骨髓,肝素鈉抗凝。加入37 ℃溫浴的2.7% 甲基纖維素,終濃度為0.1%,置于37 ℃、5%二氧化碳、97% 濕度的培養(yǎng)箱中靜置30 min。吸取上層有核細(xì)胞層,加入Ficoll-Hypaque 淋巴分離液,2000 r/min 離心30 min,分離MNC 細(xì)胞。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2 次,加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。

        1.2.2

        實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-335-3p 表達(dá)水平 用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)后,行PCR 反應(yīng)。引物序列:miR-335-3p 正向5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3',反向5'-GGTCAG GAGCAATAATGAAAAA-3';U6 正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向5'-AC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。用2法計(jì)算miR-335-3p 相對(duì)U6 的表達(dá)量。

        1.2.3

        細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取6 孔板,加2.5 mL 對(duì)數(shù)期KM3細(xì)胞懸液(2.5×10/mL),培養(yǎng)12 h 后,用Lipofectamine2000 試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 miR-335-3p 組:轉(zhuǎn)染miR-335-3p mimics;miR-NC 組:轉(zhuǎn)染模擬對(duì)照序列;pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組:共轉(zhuǎn)染MDM2 過(guò)表達(dá)載體和miR-335-3p mimics;pcDNA3.1+miR-335-3p 組:共轉(zhuǎn)染空載體和miR-335-3p mimics。轉(zhuǎn)染6 h 后,更換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.4

        MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取96 孔板,加200μL上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液(2.5×10/mL),分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。然后加20 μL MTT(5 g/L)。孵育4 h后,棄培養(yǎng)基。加150 μL 二甲基亞砜溶液,振蕩均勻,于全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

        1.2.5

        流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取6 孔板,加2.5 mL 上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液(2.5×10/mL),培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞。PBS 清洗細(xì)胞3 次,利用Annexin VFITC/碘化丙啶(PI)試劑盒,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

        1.2.6

        蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax 和MDM2 蛋白表達(dá) 取6 孔板,加2.5 mL 上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液(2.5×10/mL),培養(yǎng)48 h 后,收集細(xì)胞,用RIPA 裂解液提取細(xì)胞中總蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白含量。行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。 于4 ℃冰箱中分別用cyclin D1(1∶800)、P21(1∶400)、Bcl-2(1∶600)、Bax(1∶600)、MDM2(1∶400)和GAPDH 一抗孵育過(guò)夜,洗膜后,再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶200)室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑,避光顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。Image J 軟件分析目的蛋白相對(duì)GAPDH 的表達(dá)量。

        1.2.7

        雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) PCR 計(jì)數(shù)擴(kuò)增含miR-335-3p 結(jié)合位點(diǎn)的MDM2 的3’非翻譯區(qū)(UTR),插入載體,構(gòu)建MDM2 的3’UTR 野生型熒光素酶報(bào)告載體(WT-MDM2);突變結(jié)合位點(diǎn),插入載體,構(gòu)建MDM2 的3’UTR 突變型熒光素酶報(bào)告載體(MUT-MDM2),該過(guò)程由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。用Lipofectamine2000 試劑盒分別將WT-MDM2與miR-335-3p mimics、WT-MDM2與miRNC、MUT-MDM2 與miR-335-3p mimics 及MUTMDM2 與miR-NC 共轉(zhuǎn)染至KM3 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h 后,更換為完全培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h 后,收集各組細(xì)胞,參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

        2 結(jié)果

        2.1 骨髓瘤細(xì)胞系中miR-335-3p 表達(dá)水平

        qRTPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,骨髓瘤細(xì)胞KM3 和U266 中miR-335-3p 表達(dá)水平分別為0.24±0.01、0.38±0.02,顯著低于正常骨髓細(xì)胞MNC 中的miR-335-3p 表達(dá)水平0.77±0.03(

        t

        =29.029、18.735,均

        P

        <0.001),

        F

        =484.929,

        P

        <0.001。 由于骨髓瘤細(xì)胞KM3 中miR-335-3p 表達(dá)水平相對(duì)低于U266 細(xì)胞(

        t

        =15.340,

        P

        <0.001),因此,選擇KM3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.2 過(guò)表達(dá)miR-335-3p 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3 增殖的影響

        miR-335-3p 組KM3 細(xì)胞中miR-335-3p 表達(dá)水平為0.48±0.03,高于miR-NC 組的0.21±0.01(

        t

        =14.789,

        P

        <0.001),說(shuō)明miR-335-3p mimics 轉(zhuǎn)染成功,KM3 細(xì)胞中miR-335-3p 過(guò)表達(dá)。MTT 法與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,與miR-NC 組比較,miR-335-3p組KM3 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h 后吸光度降低(均

        P

        <0.05),細(xì)胞中cyclin D1 蛋白表達(dá)降低(

        P

        <0.001),P21 蛋白表達(dá)升高(

        P

        <0.05),表明過(guò)表達(dá)miR-335-3p可抑制KM3細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1。

        表1 過(guò)表達(dá)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3增殖的影響/±s

        2.3 過(guò)表達(dá)miR-335-3p 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3 凋亡的影響

        流式細(xì)胞儀與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,miR-335-3p 組KM3 細(xì)胞凋亡率為(24.31±0.99)%,高于miR-NC 組的(8.13±0.83)%(

        t

        =37.573,

        P

        <0.001);細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)水平為(0.71±0.07),高于miR-NC 組的(0.19±0.02)(

        t

        =106.066,

        P

        <0.001);Bcl-2 蛋白表達(dá)水平為(0.32±0.03),低于miR-NC 組的(0.81±0.08)(

        t

        =110.309,

        P

        <0.001),表明過(guò)表達(dá)miR-335-3p能夠促進(jìn)KM3細(xì)胞凋亡。

        2.4 miR-335-3p 靶向調(diào)控MDM2

        TargetScan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示的MDM2 的3’UTR 與miR-335-3p 互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列見(jiàn)圖1A。共轉(zhuǎn)染miR-335-3p與WT-MDM2的KM3細(xì)胞熒光素酶活性為0.47±0.03,顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-335-3p 與WTMDM2 的0.97±0.05(

        t

        =14.852,

        P

        <0.001);共轉(zhuǎn)染miR-335-3p 與MUT-MDM2 的KM3 細(xì)胞熒光素酶活性為0.96±0.08,與共轉(zhuǎn)染miR-NC 與MUT-MDM2 的1.01±0.09 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

        t

        =0.719,

        P

        =0.512),說(shuō)明miR-335-3p 可與MDM2 的3’UTR 序列結(jié)合。miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達(dá)水平為0.14±0.02,顯著低于miR-NC 組的0.63±0.06(

        t

        =18.981,

        P

        <0.001);anti-miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達(dá)水平為0.97±0.06,顯著高于anti-miR-NC 組的0.67±0.04(

        t

        =7.206,

        P

        <0.001)。表明miR-335-3p在KM3細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控MDM2表達(dá),見(jiàn)圖1B。

        圖1 miR-335-3p靶向調(diào)控MDM2表達(dá):A為MDM2的3’非翻譯區(qū)(UTR)與miR-335-3p互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列;B為miR-335-3p靶向調(diào)控MDM2蛋白表達(dá)

        2.5 過(guò)表達(dá)MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3 增殖的影響

        與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較,pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h后吸光度顯著升高(均

        P

        <0.05),KM3細(xì)胞中cyclin D1 蛋白表達(dá)顯著升高(

        P

        <0.05),P21 蛋白表達(dá)顯著降低(

        P

        <0.05),表明過(guò)表達(dá)MDM2 部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-335-3p 對(duì)KM3 細(xì)胞增殖的抑制作用。見(jiàn)圖2、表2。

        表2 過(guò)表達(dá)MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3增殖的影響/±s

        圖2 過(guò)表達(dá)MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3增殖的影響

        2.6 過(guò)表達(dá)MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3 凋亡的影響

        與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較,pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細(xì)胞的凋亡率顯著降低(

        P

        <0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(

        P

        <0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(

        P

        <0.05)。見(jiàn)表3。

        表3 過(guò)表達(dá)MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對(duì)KM3細(xì)胞凋亡的影響/±s

        3 討論

        miRNA 是一類(lèi)小分子非編碼RNA,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。研究已顯示,多種miRNA 在骨髓瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。miR-19a 在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株LP-1 和U266 中表達(dá)水平顯著升高,miR-19a 能夠促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并抑制骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。多發(fā)性骨髓瘤病人血清中miRNA-181a 呈高表達(dá),抑制miRNA-181a表達(dá)可降低骨髓瘤RPM18226 細(xì)胞的存活、集落形成和遷移能力。miRNA-20a在多發(fā)性骨髓瘤病人血漿中表達(dá)升高,其可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖,抑制骨髓瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng),是治療多發(fā)性骨髓瘤的潛在靶點(diǎn)。研究骨髓瘤病人機(jī)體內(nèi)異常表達(dá)的miRNA 及其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,對(duì)了解骨髓瘤疾病發(fā)生的機(jī)制以及臨床基因治療有重要意義。

        miR-335-3p 基因定位于7q32.2,參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Luo 等研究顯示,miR-335-3p 靶向下調(diào)聚(ADP-核糖)聚合酶1 表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。Wang 等研究顯示,miR-335-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移和侵襲具有明顯抑制作用。Gao 等研究顯示,miR-335-3p 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低,與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,miR-335-3p 對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的研究還未見(jiàn)報(bào)道。骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展是瘤細(xì)胞異常增殖和凋亡抑制的結(jié)果,通過(guò)調(diào)控骨髓瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,可以延緩骨髓瘤的發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示,miR-335-3p 在骨髓瘤細(xì)胞KM3 和U266 中呈低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-335-3p 對(duì)KM3 細(xì)胞增殖活性具有明顯抑制作用,而對(duì)KM3 細(xì)胞凋亡具有明顯促進(jìn)作用,其可能通過(guò)間接調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)蛋白cyclin D1、P21、Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)發(fā)揮作用,提示miR-335-3p可能成為骨髓瘤基因治療的分子靶標(biāo)。

        miRNA 通常通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用,為了進(jìn)一步探討miR-335-3p 影響骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制,本研究證實(shí)了miR-335-3p 在KM3 細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控MDM2 表達(dá)。MDM2 是一種原癌基因,在膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究顯示,下調(diào)MDM2 表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。MDM2蛋白在骨髓瘤組織中表達(dá)升高,與病人臨床分期正相關(guān),可能與cmyc 蛋白協(xié)同促進(jìn)骨髓瘤的發(fā)展。抑制MDM2 表達(dá)可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,過(guò)表達(dá)MDM2 可通過(guò)激活E2F-1和下調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白(wtp53和p21)來(lái)加速骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究顯示,過(guò)表達(dá)MDM2 部分逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-335-3p對(duì)骨髓瘤細(xì)胞KM3增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,提示miR-335-3p 通過(guò)下調(diào)MDM2表達(dá)抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡。

        綜上所述,miR-335-3p 在骨髓瘤細(xì)胞中呈低表達(dá),其可能通過(guò)下調(diào)MDM2 表達(dá)抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,miR-335-3p/MDM2軸可能為骨髓瘤的治療提供了新靶點(diǎn),但尚需動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證miR-335-3p/MDM2 軸對(duì)骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的影響。

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