蔡丙嚴，田其真，戴建華，穆曉惠，白佑博

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

0 引言

禽白血病(Avain leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avain leuckosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒引起的禽類多種腫瘤型疾病的統(tǒng)稱[1]。禽白血病分布范圍廣，是一種全球性的傳染病，病毒既可以垂直傳播也可以水平傳播[2]。雞群一旦感染，會造成內(nèi)臟器官的腫瘤、免疫抑制、生長與生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[3]。隨著近年來對外源性禽白血病J亞群的深入研究[4]，發(fā)現(xiàn)其危害較大，能引起病雞發(fā)生血管瘤和急慢性腫瘤，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。不同類型、不同品系原種雞場核心群的外源性禽白血病的凈化，是預(yù)防禽白血病最基本也是最重要的一環(huán)[5]。中小規(guī)模自繁自養(yǎng)的雞群，尤其是一些地方品種的雞群，對禽白血病的凈化工作不到位，致使雞群的感染率在30%以上[6]。因此，有必要對一些有價值的地方品種雞群盡快啟動AL凈化程序[7]。目前，種雞場開展的AL凈化方法主要是檢測、淘汰與做好生物安全措施。臨床實踐中，常采用p27抗原免疫膠體金試紙條、ELISA試劑盒及PCR等檢測技術(shù)進行檢測。蘆花雞、蘇禽綠殼雞和新楊黑雞為我國土生或自主培育的蛋肉兼用品種。為了解這3個地方品種雞中ALV的自然感染狀態(tài)，項目組分兩批次采集泄殖腔棉拭子與血清樣品，采用免疫膠體金試紙和ELISA 2種方法進行ALV的檢測，并通過PCR方法檢測了雞群中ALV-J亞群感染情況，同時，對檢測出的陽性雞只及時進行淘汰。研究結(jié)果為我國地方品種雞ALV的防控提供了重要的監(jiān)測數(shù)據(jù)，為進一步做好ALV的凈化工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及引物設(shè)計

ALV p27抗原檢測試紙條(揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點實驗室研發(fā)產(chǎn)品)；DNA Marker、dNTP等試劑(購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)；DNA提取試劑盒(購自AXYGEN公司)；禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(購自愛德士(IDEXX)生物科技有限公司)。參考文獻[8]設(shè)計鑒定ALV-J的RT-PCR引物H5/H7序列為：H5 5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAC-3′/H7 5′-CGACCAAAGGTAACACACG-3′，PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min；擴增ALV-J的pol至gp85基因片段，預(yù)計大小545bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 檢測方法

對蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞，于15周齡、25周齡分2批次采集泄殖腔棉拭子于裝有含雙抗PBS的指形管中，采集后24 h內(nèi)送回實驗室凍融，檢測前將樣品液氮中反復(fù)凍融2次，恢復(fù)至室溫，沉淀雜質(zhì)，按p27抗原試紙條說明書進行檢測；無菌翅靜脈采血2 mL，分離血清，按ELISA試劑盒說明書進行檢測；無菌采集陽性雞的抗凝血樣品2 mL，4℃冰箱保存不超過12 h，按照試劑盒說明提取基因組，擴增ALV-J的pol至gp85基因片段。

1.3 雞群凈化

根據(jù)每次檢測結(jié)果，淘汰p27抗原陽性雞只；嚴格執(zhí)行生物安全措施，雞舍及其周圍用 1：500的比例稀釋的二氯異氰尿酸鈉消毒不少于2次/d[9]；雞舍飼養(yǎng)管理實行定員責(zé)任制，及時清理雞糞并做無害化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 p27抗原試紙條檢測結(jié)果

在15周齡，分別采集蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個地方品種雞泄殖腔棉拭子樣品各700份，總計2 100份。檢測結(jié)果顯示，陽性數(shù)共計644份，總陽性率為30.67%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞的陽性率分別為32.42%、24.57%、35.00%。在25周齡，分別采集蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個地方品種雞泄殖腔棉拭子樣品各500份，總計1 500份。檢測結(jié)果顯示，陽性數(shù)共計159份，總陽性率為11.20%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞的陽性率分別為11.80%、7.20%、14.60%，具體如表1所示。

表1 三個地方品種雞15、25周齡ALV p27抗原試紙條檢測陽性率

2.2 p27抗原ELISA檢測結(jié)果

在15周齡和25周齡分2批次對蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞共采集600份血清樣品進行檢測。檢測結(jié)果顯示：15周齡時，陽性數(shù)共計113份，總陽性率為31.38%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞的陽性率分別為34.16%、24.16%、35.83%；25周齡時，陽性數(shù)共計30份，總陽性率為12.50%，其中蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞的陽性率分別為12.50%、8.75%、15.00%，具體如表2所示。

表2 三個地方品種雞15、25周齡ALV p27抗原ELISA檢測陽性率

2.3 ALV-J亞群抗原PCR檢測結(jié)果

無菌采集陽性雞的抗凝血樣品2 mL，4℃冰箱保存不超過12 h，按照試劑盒說明提取基因組，擴增ALV-J的pol至gp85基因片段。大小約545 bp，如圖1所示。

圖1 ALV-J的pol至gp85基因PCR擴增片段

2.4 雞群凈化結(jié)果

綜合ALV p27抗原試紙條和p27抗原ELISA檢測結(jié)果，雞場對15周齡檢測出陽性的雞只進行了淘汰，并采取了加強飼養(yǎng)管理、消毒及無害化處理等凈化控制措施，至25周齡檢測時，雞群ALV陽性率顯著下降，ALV p27抗原試紙條檢測總陽性率由15周齡的30.67%下降至11.80%，共下降了19.47%，ALV p27抗原ELISA檢測總陽性率由15周齡的31.38%下降至12.50%，共下降了18.88%，2種檢測方法陽性率較為一致，由此看出經(jīng)過兩次的檢測淘汰，雞場AL的凈化成效非常顯著，結(jié)果如表1、表2所示。

3 討論

國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020 年)中明確提出，禽白血病是國家優(yōu)先防治的傳染病。深入研究禽白血病，有效防控和消滅禽白血病，對促進我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義[10]。AL在我國養(yǎng)禽業(yè)中是一種普遍現(xiàn)象，ALV在雞群特別是我國地方品種的雞群中廣泛存在。崔治中[6]等對廣東某“三黃雞”種雞場禽白血病的檢測顯示，3 個地方品種的祖代雞均感染了禽白血病病毒，且感染比例平均達33%。姬向波[11]等對河南省5個地方品種雞禽白血病病毒檢測顯示，河南地方品種雞群總體ALV p27抗原陽性率為泄殖腔拭子22.62%、血清26.83%、蛋清12.90%；5個品種雞群的血清ALV p27陽性率依次為河南斗雞84.48%、淅川烏骨雞53.78%、固始雞19.81%、三黃雞17.22%、盧氏雞16.67%，但同品種不同場區(qū)間差異較大。本研究結(jié)果顯示，蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑雞3個地方品種雞15周齡首次檢測時泄殖腔樣品p27抗原試紙檢測陽性率分別32.42%、24.57%、35.00%；血清樣品ELISA檢測陽性率分別為34.16%、24.16%、35.83%，研究結(jié)果與崔治中等對“三黃雞”的檢測比較接近，與姬向波等對河南5個地方品種雞的結(jié)果差異較大，可能與不同品種雞、不同檢測周齡等有關(guān)。

ALV p27抗原快速檢測試紙條具有操作簡便、快速出結(jié)果、敏感性高等優(yōu)點，尤其是適合種雞場快速、大規(guī)模禽白血病的檢測與凈化工作。但實踐操作中，影響檢測結(jié)果的主要因素有泄殖腔拭子稀釋液緩沖液的量、反復(fù)凍融次數(shù)、試紙條反應(yīng)的時間等，因此，應(yīng)想辦法創(chuàng)造好的檢測條件，以免影響檢測結(jié)果的準確性。ALV p27抗原ELISA試劑盒具有檢測快速、敏感性高、操作簡便、易于標準化等優(yōu)點，但由于其檢測樣品多為血清，對樣品采集、實驗操作、設(shè)備等都有較高的要求，適合用于種雞場核心雞群的復(fù)檢工作。本研究同時運用2種ALV檢測方法，分2個時期對蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞的泄殖腔拭子和血清樣品進行了檢測，結(jié)果顯示，2種檢測方法符合率達到98.70%。因此，建議種雞場首次對雞群大面積調(diào)查ALV感染情況時采用p27抗原快速檢測試紙條，對于核心種雞群進行ALV復(fù)檢時運用ALV p27抗原ELISA試劑盒檢測，以減少相關(guān)工作量。

ALV-J亞群白血病病毒是20世紀80年代末分離并鑒定出的雞白血病病毒的一個新的亞群[12]。該群病毒主要引起肉用型雞的骨髓樣細胞瘤，而蛋用型雞自然感染時很少引起腫瘤。當前我國雞群 ALV-J的問題集中在各地自繁自養(yǎng)的培育型黃羽肉雞及我國地方品種雞中。唐中文[13]對安徽省16例疑似感染禽白血病的地方品種雞，通過 PCR擴增方法對患病雞檢測、ALV-Jgp85基因擴增、測序、分析比較，結(jié)果檢出10份J亞群禽白血病病毒。王培坤等[14]對疑似患有禽白血病的廣西麻雞進行病理剖檢、接種DF-1細胞進行病毒分離以及對細胞培養(yǎng)上清進行p27抗原檢測、細胞培養(yǎng)物進行PCR擴增，并對分離到病毒的gp85基因進行測序和分析比較。結(jié)果表明，從該病雞同時分離到了A亞群禽白血病病毒(ALV-A)與J亞群禽白血病病毒(ALV-J)。本研究采集部分p27抗原檢測陽性雞的抗凝血40份，提取基因組，擴增ALV-J的pol至gp85基因片段進行PCR檢測，結(jié)果有32份樣品擴增出545 bp目的片段，表明這蘆花、蘇禽綠殼和新楊黑這3個地方品種雞主要感染的禽白血病病毒類型為ALV-J亞群禽白血病病毒。本研究結(jié)果與唐中文、王培坤對地方品種雞ALV-J亞群禽白血病的檢測一致，更進一步論證了ALV-J亞群禽白血病病毒為當前地方品種雞禽白血病的主要感染類型。

4 結(jié)語

目前，尚無有效的疫苗預(yù)防禽白血病，因此，采取嚴格的生物安全措施，進行病原檢測、淘汰外源性ALV所感染的雞只、凈化種群等方法控制該病是一項緊迫的任務(wù)。對于自繁自養(yǎng)的地方品種原種雞場核心群白血病的凈化，對預(yù)防和控制禽白血病顯得至關(guān)重要，做到從源頭消滅傳染源。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過15周齡、25周齡2個禽白血病病毒排毒高峰期的檢測、淘汰陽性雞、嚴格執(zhí)行生物安全等措施，蘆花、蘇禽綠殼、新楊黑3個地方品種雞ALV總陽性率下降了18.88%～19.47%，雞場AL的凈化成效非常顯著。總結(jié)本研究成效顯著的原因主要為：這3個地方品種雞感染的主要是外源性ALV-J亞群禽白血?。槐狙芯坎捎肁LV p27抗原檢測試紙條與ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒2種檢測方法的同時運用，可檢測出所有亞群禽白血病病毒共有的p27抗原[9]，將內(nèi)源性和外源性禽白血病同時檢測剔除；同時執(zhí)行嚴格的淘汰和生物安全措施降低了禽白血病的外源性感染。研究結(jié)果為地方品種雞禽白血病的檢測、凈化提供了依據(jù)與參考。