陳欣欣，章樂虹

miRNAs在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了非 常重要的作用［1-3］。到目前為止大部分的研究證實了miRNA主要通過作用于目的mRNA的3′?UTR從而抑制其轉(zhuǎn)錄［2］，在近些年也有研究證實了miRNA能夠作用于mRNA的CDS區(qū)域或者5′UTR區(qū)域［4］，miRNA作用于目的基因啟動子的報道較少。miR103A?3p（以下稱miR103A）參與調(diào)節(jié)多個細胞過程，如細胞分裂、細胞代謝和應(yīng)激、血管生成等［5，6］。然而對miRNA的研究越深入，我們發(fā)現(xiàn)各種信號通路可以通過不同的microRNA調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，相同的microRNA也可以作用不同的基因或者信號通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此多個調(diào)控通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究已成為microRNA在腫瘤研究中的主導(dǎo)方向。本研究旨在探索miR103A通過下調(diào)抑癌基因RGS2的表達進而影響乳腺癌的進展，以及miR103A與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。

RGS2（regulator of G?protein signaling 2）屬于RGS蛋白家族，是GPCR的效應(yīng)因子，主要對細胞生長起到負向調(diào)控作用［7，8］，RGS2功能失調(diào)往往導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以下研究探討了RGS2作為內(nèi)源性miR103A靶基因，其功能受到抑制可能導(dǎo)致乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。

1 材料和方法

1.1 熒光雙報告系統(tǒng)檢測miR103A對RGS2啟動子活性的影響

設(shè)置質(zhì)粒組（RGS2啟動子片段的?Luc/Rluc的重組質(zhì)粒），質(zhì)粒+miRNA NC組以及質(zhì)粒+miRNA mimics（帶有Luc/Rluc標(biāo)記的報告基因和miR103A mimics）組，共轉(zhuǎn)染293 T細胞。按照每孔50 ng質(zhì)粒，同時每孔20μL無血清培養(yǎng)基計算需用量，標(biāo)記為A。配置miRNA NC/mimics的終濃度為20 nmol/L，同時每孔20μL無血清培養(yǎng)基計算需用量，分別標(biāo)記為B、C。

1.2 標(biāo)本及試劑

選取2019年1月至10月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，收集的乳腺癌組織及癌旁組織樣本27對，年齡34~68歲，平均（49.6±1.56）歲，收集新鮮癌組織樣本69例，年齡28~74（51.33±1.25）。在采集樣本時已征得患者同意。納入標(biāo)準：①女性；②原發(fā)性乳腺癌；④無伴發(fā)其他腫瘤；④術(shù)前未接受過放化療。排除標(biāo)準：組織量太少不能進行重復(fù)試驗者。標(biāo)本采集取得了廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會同意。PCR引物由Life公司合成，轉(zhuǎn)染、Western Blotting及Real?Time PCR，熒光雙報告試劑盒從日本TAKARA公司購買，RGS2抗體從英國Abcam公司購買，miRNA mimics由上海吉瑪公司合成。

1.3 樣本處理

將手術(shù)切除的乳腺癌組織及正常乳腺癌組織切成2 mm厚度后分裝事先做好標(biāo)記的凍存管中并放入液氮中保存。使用時將約100 g組織切片在液氮中研碎后融入1 mL的Trizol中裂解后提取總RNA行qRT?PCR檢測。

所采用的細胞為MCF?7以及MDA?MB?231細胞系，轉(zhuǎn)染小分子RNA的轉(zhuǎn)染試劑為RNAimax，opti?MEM，轉(zhuǎn)染48 h后收樣提取總RNA行qRT?PCR檢測，同時收集細胞裂解后提取蛋白進行Western Blotting檢測，所有的操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，miR103A在LN+/LN-，HER2+/HER2-的表達比較用Mann Whitney test進行分析，乳腺癌及正常乳腺組織中RGS2的表達差異檢驗方法為配對資料的秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR103A在乳腺癌中高表達

為了了解乳腺癌中小分子RNA的分布及表達情況，本研究收集3對乳腺癌及正常乳腺組織新鮮樣本進行小分子RNA深度測序，發(fā)現(xiàn)miR103A在乳腺癌組織中的含量較高，且在癌組織以及正常乳腺組織中的表達差異較大（圖1A），同時細胞實驗證實miR103A在乳腺癌細胞系中的表達也明顯高于乳腺上皮細胞系（圖1B）。為了進一步明確miR103A是否與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，作者收集了69例患者的新鮮癌組織標(biāo)本，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為28例，HER2+的乳腺癌為23例。qPCR檢測miR103A的相對表達，分析其表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。miR103A在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及HER2+的患者中表達明顯高于淋巴結(jié)陰性或者HER2?的患者（圖1C、1D），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.0001）。

圖1 miR103A在乳腺癌中的表達A：深度測序發(fā)現(xiàn)乳腺癌中miR103A的表達上調(diào)；B：miR103A在乳腺癌細胞系及乳腺上皮細胞中的表達情況；C：miR103A在HER2+的腫瘤中高表達；D：miR103A在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中高表達

2.2 RGS2基因在乳腺癌細胞系中的表達受miR103A抑制，且在乳腺癌中低表達

本研究將人工合成的miR103A（micro RNA mimics）轉(zhuǎn)入MCF?7以及MDA?MB?231細胞系中，孵育48 h后收樣，進行RT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR103A下調(diào)了乳腺癌細胞中RGS2 mRNA的表達（圖2A），同時收集細胞提取蛋白進行western?Blot檢查發(fā)現(xiàn)miR103A下調(diào)了乳腺癌細胞中RGS2蛋白表達（圖2B、2C）。為了進一步明確RGS2在乳腺癌中的表達，本研究收集27例乳腺癌患者新鮮乳腺癌組織及正常乳腺組織，提取總RNA后行QPCR檢測發(fā)現(xiàn)RGS2在乳腺癌中低表達（圖2D，N=27）。

圖2 乳腺癌中miR103A和RGS2的關(guān)系A(chǔ)：miR103A下調(diào)乳腺癌細胞中RGS2 mRNA的表達；B、C：miR103A下調(diào)乳腺癌細胞中RGS2蛋白水平的表達；D：RGS2在乳腺癌中低表達（n=27），檢驗方法為配對資料的秩和檢驗，P＜0.05

2.3 miR103A作用于RGS2基因的啟動子

通過在線生信分析發(fā)現(xiàn)miR103A與RGS2啟動子區(qū)匹配較好，可能通過作用于RGS2的啟動子發(fā)揮作用，準備含有RGS2啟動子片段的?Luc/Rluc的重組質(zhì)粒；帶有Luc/Rluc標(biāo)記的報告基因和miR103A mimics共轉(zhuǎn)染293T細胞，孵育48 h后收樣，使用GENios Pro酶標(biāo)儀進行熒光強度檢測，發(fā)現(xiàn)miR103A抑制了RGS2啟動子活性（圖3A、B）。

圖3 miR103A在RGS2的作用位點A：在線生物信息學(xué)分析證實miR103A在RGS2的靶位點為RGS2啟動子；B：miR103A抑制了RGS2啟動子活性

2.4 miR103A調(diào)節(jié)了乳腺癌細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達

既往有研究表明miR103A/miR107家族的miRNAs能夠促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移，為了驗證miR103A促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，研究設(shè)計觀察miR103A對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial?Mesenchymal Transition，EMT）的影響，EMT過程中最重要的表型變化為E?cadherin下調(diào)。本研究將miR103A mimics轉(zhuǎn)入MCF?7細胞系中，孵育48 h后收樣，進行West?ern?Blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR103A下調(diào)了E?cadherin蛋白的表達，上調(diào)了乳腺癌細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因SNAIL及Vimentin蛋白表達（圖4A、4B、4C）。

鑒于miRNA可能通過多個信號通路或者基因參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，本研究驗證了miR103A對其他腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響。MMP?9主要功能是降解和重塑細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，并且MMP?9可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以參與血管生成，VGEF可以促進腫瘤血管的形成，二者都在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮非常重要的作用，為了進一步證實miR103A促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用，本研究將miR103A mimics轉(zhuǎn)入MCF?7細胞系中，孵育48小時后收樣，進行Western?Blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR103A上調(diào)了乳腺癌細胞中MMP?9以及VGEF基因的表達（圖4D）。

圖4 miR103A調(diào)節(jié)乳腺癌細胞EMT以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 圖A～C：miR103A下調(diào)了乳腺癌細胞中E?cadherin的表達，上調(diào)了乳腺癌細胞中SNAIL和Vimentin的表達；圖D：miR103A上調(diào)乳腺癌細胞中MMP?9及VGEF的表達

3 討論

MiR?103A?3p已被證明在DNA修復(fù)、代謝、細胞周期進展和細胞分化等細胞過程中發(fā)揮重要作用，其功能失調(diào)導(dǎo)致代謝性疾病的發(fā)生例如腫瘤、糖尿病、阿爾茨海默病等等［9-12］。本研究通過小分子RNA深度測序證實了內(nèi)源性的miRNA103A在乳腺癌中高表達，收集乳腺癌的組織驗證發(fā)現(xiàn)miR103A在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中以及HER2+的乳腺癌中高表達，說明miR103A在乳腺癌中可能發(fā)揮了促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

通過在線生物信息學(xué)分析進行匹配，發(fā)現(xiàn)miR103A與RGS2的啟動子序列匹配度較高，熒光雙報告也證實了miR103A調(diào)節(jié)了RGS2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，說明miR103A在乳腺癌中是通過抑制基因RGS2的轉(zhuǎn)錄從而影響腫瘤的進展，且miR103A是作用于RGS2的啟動子。關(guān)于miRNA作用于目的基因的啟動子的報道較少，大多數(shù)miRNAs通過作用于mRNA的3′UTR形成“RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體”來抑制基因表達，蛋白翻譯或mRNA降解［13］。也有研究表明5′UTR和外顯子也可能是miRNAs翻譯抑制的作用目標(biāo)。此外，miRNA還可以進入細胞核，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達［14］。這些發(fā)現(xiàn)揭示了miRNA可以利用多種作用模式調(diào)控基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的小分子RNA miR?NA103A可以作用于目的基因的啟動子，更有趣的是，對基因啟動子的調(diào)控往往激活基因的轉(zhuǎn)錄，本研究卻發(fā)現(xiàn)了miR103A下調(diào)了RGS2的mRNA水平以及蛋白水平。RGS2因為對細胞生長有負向調(diào)控作用，RGS2表達抑制意味著細胞生長失去控制，而miR103A通過下調(diào)RGS2 mRNA水平以及蛋白水平而使細胞生長失去控制，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進展。

目前已經(jīng)證實的MiR?103A?3p的目的基因較少。RGS2又被稱為細胞生長抑制基因，G0/G1轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)基因；所編碼的RGS2蛋白也被稱為G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白，細胞生長抑制蛋白，G0/G1轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)蛋白［15，16］。在雄激素敏感型前列腺癌中沉默RGS2基因在缺乏雄激素的情況下可以激活A(yù)R來促進細胞生長，RGS2缺失在前列腺癌中通過各種GPCRs激活A(yù)R，導(dǎo)致激素難治性前列腺癌的發(fā)生［7］。還有文獻報道RGS2在進展期結(jié)腸癌中低表達［17］；研究發(fā)現(xiàn)RGS2在絕大部分的癌組織中低表達，包括膀胱癌，乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肺癌、卵巢及皮膚癌［18-20］。這些都說明RGS2下調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究證實了RGS2在乳腺癌中低表達，這說明RGS2功能失調(diào)影響了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

既往的研究表明miR103A促進腫瘤的轉(zhuǎn)移［5］，本研究也證實了miR103A可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而賦予癌細胞遷移和侵襲性。EMT過程中的一個關(guān)鍵事件是E?cadherin的下調(diào)，E?cadherin作為腫瘤抑制因子，抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)常被抑制或降解。E?cadherin的下調(diào)伴隨著β?catenin的核積累以及N?鈣粘蛋白和波形蛋白的表達增加，并增加Snail及Slug的表達從而進一步抑制E?cadherin的產(chǎn)生［21，22］，本研究證實了miR103A可以抑制E?cadherin的表達，上調(diào)Snail和Vimentin的表達，從而增加癌細胞的侵襲性。MMP?9是腫瘤的獨特靶點，它幾乎參與了從原發(fā)腫瘤生長、癌細胞進入淋巴和血管、遷移到其他器官等所有癌癥轉(zhuǎn)移的步驟［23-25］。MMP?9也有助于血管新生，而新生血管的生長對于維持腫瘤生長是至關(guān)重要的［26，27］。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR103A后乳腺癌細胞系內(nèi)的MMP?9、VGEF表達也隨之上調(diào)，說明兩者之間也有交互作用，進一步說明miR103A影響了EMT以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，通過影響這些基因的激活或抑制則進而影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

在乳腺的各項高危因素中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HER2過表達患者容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［28］，本研究發(fā)現(xiàn)了miR103A在LN+的患者以及HER2+的患者的癌組織中明顯高表達，這說明miR103A高表達的乳腺癌患者預(yù)后不良，這與我們在細胞水平的研究一致，提示miR103A可以影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

本研究從證實了miR103A影響了腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因的表達，且發(fā)現(xiàn)miR103A在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中高表達，證實miR103A參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)環(huán)節(jié)，說明miR103A高表達的患者可能需要更為積極的治療，本文的局限性在于隨訪時間不夠，無病生存事件數(shù)不夠，不能進行生存分，此項分析在以后的研究中進行。

綜上所述，本研究證實了內(nèi)源性miR103A在乳腺癌中可以通過作用目的基因的啟動子從而抑制基因mRNA水平以及蛋白水平的表達，我們的研究也證明了miR103A再乳腺癌中的作用機制多樣性，可能涉及多個腫瘤相關(guān)基因影響乳腺癌轉(zhuǎn)移。