曹杰，曾輝，黃旭華

1.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.南康區(qū)第一人民醫(yī)院，江西 贛州 341400

腦卒中是由于腦內(nèi)血管破裂或者阻塞引起的局部大腦血液供應不足，腦組織發(fā)生病變壞死的一種腦部疾病，其中大部分為缺血性腦卒中［1］。腦卒中發(fā)病人數(shù)多，有較高的死亡率和復發(fā)率。腦卒中對人機體損傷極大，每年患者不斷增多。但治療方式還十分缺乏，主要還是以預防為主［2］。近年來，抑制缺血再灌注導致的血腦屏障損傷已成為治療腦卒中的新思路［3］，但近幾年來未見相關文獻報道。探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對腦卒中小鼠缺血再灌注后腦微血管內(nèi)皮細胞的影響的機制，對腦卒中的治療有一定幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF 級C57BL 小鼠80 只，6 周齡，體質量范圍20～25 g，雌雄各半，購自武漢萬千佳興公司。飼養(yǎng)環(huán)境為（1）符合國標的生活環(huán)境；（2）符合國標的飼料；（3）無致病菌或無菌的飲用水。ELISA試劑檢測盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Evans blue 染色劑（上海躍騰生物技術有限公司）；RTPCR 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；顯微鏡。

1.2 實驗方法

小鼠隨機分為A 組（缺血0 min）、B 組（缺血時間30 min）、C 組（缺血時間45 min）、D 組（缺血時間60 min）。除A 組外小鼠利用線栓法［4］構建缺血再灌注小鼠模型。首先，刮掉小鼠頸部的毛，切開皮膚，分離周圍組織使左側頸總動脈顯露，結扎左側頸總動脈和頸外動脈近心端，插線栓入頸內(nèi)動脈主干，緩緩推進，血流讀數(shù)驟降停止推進，固定栓線。缺血時間到達之后，立即取出線栓，蘇醒后根據(jù)Longas 評分標準［5］進行評分，1～3 分的小鼠納入實驗。1 d 后檢測各項指標。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 ELISA 檢測血清TNF-α 表達 每組各選取10只小鼠，取靜脈血1 mL，按照ELISA 試劑盒說明書測定其中TNF-α 的水平。

1.3.2 Evans blue 法 每組另選取10 只小鼠，從眼窩靜脈竇注射濃度為2%的Evans blue 至正常小鼠和腦卒中模型小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射200 μL。體內(nèi)循環(huán)1 d，處死小鼠，取大腦并拍照。拍照之后，立即將大腦勻漿。通過酶標儀檢測吸光度（OD620和OD740），計算出正常小鼠和腦卒中小鼠的腦內(nèi)Evans blue 的濃度。

1.3.3 免疫組化檢測 Wnt3a 表達用Wnt3a 單克隆抗體進行免疫組織化學染色。步驟：脫蠟、抗原修復，3%H2O2孵育10 min，滴加封閉用正常血清，PBS洗3 遍，室溫孵育1 h，滴加1∶50 稀釋的一抗，4℃過夜。PBS 沖洗，滴加辣根酶標記二抗，室溫1 h，PBS 沖洗，DAB 顯色劑顯色。顯微鏡下拍攝，陽性表達呈棕黃色。

1.3.4 qPCR 技術檢測Axin2、APCDD1 表達 提取總RNA 后，RT-PCR 試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。通過熒光定量PCR 擴增目的基因。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s、62 ℃退火/延伸60 s，40 個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠血清TNF-α 水平以及腦內(nèi)Evans blue 濃度

A 組TNF-α 水平較低，B、C、D 組水平逐漸上升（F=2 064.955，P＜0.001）。A 組左腦Evans blue 濃度較低，B、C、D 組濃度逐漸上升（F=242.961，P＜0.001）。B 組與A 組、C 組與A 組、D 組與A 組在TNF-α 水平和左腦Evans blue 濃度均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組右腦Evans blue 濃度差異無統(tǒng)計學意義（F=0.335，P=0.800）。見表2。

表1 小鼠血清TNF-α水平以及腦內(nèi)Evans blue濃度（）

表1 小鼠血清TNF-α水平以及腦內(nèi)Evans blue濃度（）

表2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Axin2、APCDD1 mRNA相對表達（）

表2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Axin2、APCDD1 mRNA相對表達（）

2.2 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Wnt3a 的表達

Wnt3a 主要以胞核表達為主。A 組小鼠Wnt3a表達很少，B、C、D 組表達依次增多。詳見圖1。

圖1 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Wnt3a的表達（化學染色，×400）

2.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Axin2、APCDD1 mRNA的表達

A、B、C、D 組Axin2、APCDD1 mRNA 相 對表達依次增多（F=292.512，1 237.411，P＜0.001）。B 組 與A 組、C 組 與A 組、D 組 與A 組 在Axin2、APCDD1 mRNA 的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

3 討論

腦卒中多發(fā)于中老年人群體，且缺血性腦卒中發(fā)病率最高［7］。部分患者通過治療雖然能夠好轉，但往往會產(chǎn)生一定程度的后遺癥，并且預后狀況也不佳。缺血性腦卒中使血腦屏障功能降低，并增加腦出血和腦水腫的風險［8］。研究表明，閉塞的腦血管在疏通之后再灌注，短時間內(nèi)就能激活一系列的生化反應，引起神經(jīng)興奮毒性、炎性因子分泌增多等［9］。炎癥因子（TNF-α）進一步激活腦血管內(nèi)皮細胞，使淋巴細胞進入血腦屏障，分泌促炎因子，從而引起大腦內(nèi)神經(jīng)細胞大量死亡。本研究結果顯示，隨著缺血時間的增加，小鼠機體產(chǎn)生的TNF-α 增多，提示腦卒中會導致機體產(chǎn)生促炎因子TNF-α，且TNF-α 水平呈缺血時間依賴性，另外左腦的Evans blue 濃度上升，表明隨缺血時間的上升血腦屏障功能下降。

Wnt 通路與腦血管生成、血-腦脊液屏障的形成及其生物學特征維持有重要聯(lián)系。Wnt3a 為Wnt信號通路的起始蛋白［10］,其表達可激活Wnt 信號通路。本實驗結果，小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Wnt3a的表達逐漸上升。提示腦卒中小鼠的Wnt 通路被異常激活，隨著缺血時間的增加，Wnt 通路被激活的情況更加嚴重。

Wnt 通路的靶基有Axin2、APCDD1。Axin 是一種構架蛋白,它能激發(fā)?-catenin 磷酸化，又能被泛素蛋白酶體分解，導致Wnt 通路保持低活性［11］。APCDD1 因子是與Wnt 信號通路密切相關的膜結合糖蛋白［12］。APCDD1 作為內(nèi)源性因子可激活或抑制經(jīng)典Wnt 信號通路。本實驗結果，腦卒中小鼠Axin2、APCDD1 的表達逐漸增加。提示W(wǎng)nt 通路被抑制，隨著缺血時間的增加，Wnt 通路的活性越低。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)腦卒中小鼠伴隨著TNF-α 水平異常增加，Wnt 通路異常激活，腦微血管內(nèi)皮細胞功能下降，Wnt 通路的靶基因表達上升。TNF-α 可能參與到調(diào)控Wnt 通路的活性來影響腦微血管內(nèi)皮細胞功能。其具體機制還有待進一步研究。