王春奎， 劉希明， 陶 宏， 段 冶， 劉 偉

(滕州市中心人民醫(yī)院麻醉科, 山東 滕州 277500)

缺血性心臟病是常見的心血管疾病，嚴重威脅人類健康。改善心肌供血，恢復缺血部分心肌血液再供是缺血性心臟病的治療宗旨[1]。但臨床顯示，缺血心肌再灌注導致心肌細胞代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞的程度加重，即產(chǎn)生心肌缺血/再灌注損傷[2]。心肌細胞的缺氧復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)是心肌缺血/再灌注損傷的主要病變基礎，與心肌細胞氧化應激和凋亡密切相關(guān)[3]，降低心肌缺血/再灌注后心肌細胞的氧化應激和凋亡可改善MI/RI。地佐辛(Dezocine)是一種新型的阿片類鎮(zhèn)痛藥，且對心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)無明顯副作用[4]。研究顯示，地佐辛預給藥可保護肢體缺血再灌注導致的心肌損傷[5]。目前，地佐辛對H/R誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響和作用機制還未知。miR-7a-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種微小RNA(microRNA，miRNA)。有報道稱，短暫局灶性缺血大鼠模型中表達降低，注射miR-7a-5p模擬物可減輕短暫局灶性缺血大鼠氧化應激和腦組織神經(jīng)元細胞凋亡[6]。生物信息學軟件預測顯示，泛素E3連接酶10(ubiquitin E3 ligase tripartite motif 10，TRIM10)是miR-7a-5p的靶基因。TRIM10具有E3連接酶功能，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡。研究顯示，TRIM10可通過介導p-JNK/p-P38MAPK途徑加重MI/RI[7]。但目前，miR-7a-5p能否靶向TRIM10影響H/R的心肌細胞氧化應激和凋亡還未知。本研究以miR-7a-5p/TRIM10軸為切入點，主要探討了地佐辛對H/R誘導的大鼠心肌細胞H9C2氧化應激和凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

大鼠心肌細胞株H9C2，上海子實生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、LipofectamineTM2000試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；B淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)，美國Santa Cruz公司；TRIM10抗體，南京安研生物科技有限公司；miR-7a-5p 模擬物(mimcs)、抑制劑及模擬對照序列，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidas，GSH-Px)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細胞，培養(yǎng)箱環(huán)境為溫度37℃、CO2體積分數(shù)5 %、O2體積分數(shù)95 %。當細胞融合至80 %～90 %時，吸棄培養(yǎng)基，0.25 %胰蛋白酶溶液消化，約1:3比例傳代培養(yǎng)。

1.3 H9C2細胞轉(zhuǎn)染

H9C2細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。當細胞融合至60 %時，分別將miR-7a-5p mimics(miR-7a-5p組)及陰性對照(miR-NC組)、miR-7a-5p抑制劑(anti-miR-7a-5p組)及陰性對照(anti-miR-NC組)轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，具體操作參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞備用。

1.4 H9C2細胞分組和處理

未轉(zhuǎn)染的H9C2細胞分為(1)對照組(Con組)：細胞正常培養(yǎng)；(2)H/R組：參照文獻方法建立H/R心肌細胞模型[8]，H9C2細胞加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入含N2體積分數(shù)95 % 和CO25 %的混合氣體，流速2 L/min，3 h后換用完全培養(yǎng)基，置于37℃、CO2體積分數(shù)5 %、O2體積分數(shù)95 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；(3)低、中、高劑量地佐辛干預組：分別采用10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L[9]的地佐辛預處理H9C2細胞24 h后，再進行H/R處理，分別記為H/R+D-L組、H/R+D-M組和H/R+D-H組。轉(zhuǎn)染后的miR-7a-5p組、miR-NC組H9C2細胞進行H/R處理，分別記為H/R+miR-7a-5p組和H/R+miR-NC組。轉(zhuǎn)染后的anti-miR-7a-5p組、anti-miR-NC組H9C2細胞均用10-5mmol/L的地佐辛預處理24 h后，再進行H/R處理，分別記為H/R+D+anti-miR-7a-5p組、H/R+D+anti-miR-NC。每組細胞設置3個復孔，實驗重復3次。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中MDA、SOD和GSH-Px

各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后，胰蛋白酶消化，收集細胞。加入細胞裂解液充分裂解，3 500 r/min離心10 min。取上清液，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書檢測上清中各指標水平。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

各組細胞培養(yǎng)后，胰蛋白酶消化，收集細胞。加入400 μl結(jié)合緩沖液，重懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。再加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax和TRIM10蛋白表達

RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，行10 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，并于5 %脫脂奶粉中封閉2 h。分別置于Bcl-2(1∶800)、Bax(1∶800)和TRIM10(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(1∶4 000)，37℃孵育1 h。滴加化學發(fā)光試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-7a-5p和TRIM10 mRNA表達

Trizol試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR反應。反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個循環(huán)。miR-7a-5p上游5'-GTCCGACGGATGAACGCTCGT-3'，下游5'-TAACCGTCG CTCGTGAAGCGC-3'；TRIM10上5'-CCGTAGTCGTAAGCCACGT-3'，下游5'-GGCGTAAA GCTCGCGTGCG-3'；GAPDH上游5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'，下游5'-TAGCCCAG GATGCCCTTTAGT-3'；U6上游5'-TTGGTATCGTGGAA-GGACTCA-3'，下游5'-TGTCATCA TATTTGGCAGGTT-3'。TRIM10以GAPDH為內(nèi)參，miR-7a-5p以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計算miR-7a-5p和TRIM10 mRNA表達水平。

1.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

PCR擴增含miR-7a-5p結(jié)合位點的TRIM10的3’UTR序列，并采用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變，分別構(gòu)建TRIM10野生型質(zhì)粒和(TRIM10-WT)和突變型質(zhì)粒(TRIM10-MUT)。分別將TRIM10-WT或TRIM10-MUT與miR-7a-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至H9C2細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞。裂解后，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 地佐辛對H/R誘導的大鼠心肌細胞氧化應激的影響

與Con組比較，H/R組MDA含量升高(P< 0.05)，SOD和GSH-Px活力降低(P<0.05)。與H/R組比較，H/R+D-L組、H/R+D-M組和H/R+D-H組MDA含量均降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力均升高(P<0.05)，且三組間各指標兩兩比較差異顯著(P<0.05，表1)。

Tab. 1 The effects of dizocine on H/R-induced oxidative stress in rat cardiomyocytes n=9)

2.2 地佐辛對H/R誘導的大鼠心肌細胞凋亡的影響

與Con組比較，H/R組細胞凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。與H/R組比較，H/R+D-L組、H/R+D-M組和H/R+D-H組細胞凋亡率和Bax蛋白水平均降低(P< 0.05)，Bcl-2蛋白水平均升高(P<0.05)，且三組間各指標兩兩比較差異顯著(P<0.05，圖1，表2)。

Fig. 1 The effects of dizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: The effect ofdizocine on the expressions of Bcl-2 and Bax in cardiomyocytes induced by H/R; B: The effect of dizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis

2.3 地佐辛對H/R誘導的大鼠心肌細胞中miR-7a-5p和TRIM10表達的影響

與Con組比較，H/R組miR-7a-5p水平降低(P<0.05)，TRIM10 mRNA和蛋白水平升高(P< 0.05)。與H/R組比較，H/R+D-L組、H/R+D-M組和H/R+D-H組miR-7a-5p水平升高(P<0.05)，TRIM10 的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)，且三組間各指標兩兩比較差異顯著(P<0.05，圖2，表3)。

Tab. 2 The effects ofdizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis n=9)

Fig. 2 The effects of dizocine on the protein expression of TRIM10 in H/R-induced cardiomyocyte

Tab. 3 The effects ofdezocine on the expressions of miR-7a-5p and TRIM10 in H/R-induced rat cardiomyocytes n=9)

2.4 miR-7a-5p靶向調(diào)控TRIM10的表達

Target Scan在線軟件預測顯示，TRIM10的3’UTR與miR-7a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(圖3A)。miR-7a-5p可降低WT-TRIM10的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而對WT-TRIM10的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05，表4)。miR-7a-5p組miR-7a-5p水平高于miR-NC組(3.54±0.135比 1.06±0.07，P<0.05)，TRIM10蛋白水平低于miR-NC組(0.23±0.02比0.49±0.04，P<0.05)；anti-miR-7a-5p組miR-7a-5p水平低于anti-miR-NC組(0.26±0.03比1.05±0.08，P<0.05)，TRIM10蛋白水平高于anti-miR-NC組(0.91±0.08比0.48± 0.05，P<0.05)，進一步說明miR-7a-5p在心肌細胞中靶向負調(diào)控TRIM10表達。

Fig. 3 miR-7a-5p targeted regulation of TRIM10 expressionA: The 3'UTR of TRIM10 contains a nucleotide sequence complementary to miR-7a-5p; B: TRIM10 protein expression

Tab. 4 Detection results of luciferase activity n=9)

2.5 miR-7a-5p過表達對H/R誘導的大鼠心肌細胞損傷的影響

H/R+miR-7a-5p組心肌細胞中miR-7a-5p水平高于H/R+miR-NC組(P<0.05)，表明miR-7a-5p mimics轉(zhuǎn)染成功，細胞中miR-7a-5p過表達。與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-7a-5p組MDA含量、細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05，圖4，表5)。

Fig. 4 The effects of over-expressing miR-7a-5p on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: The effect of over-expressing miR-7a-5p on the protein expression of TRIM10, Bcl-2 and Bax in H/R-induced cardiomyocyte; B: The effect of over-expressing miR-7a-5p on the apoptosis of cardiomyocyte by H/R induced

Tab. 5 The effects of over-expressing miR-7a-5p on H/R-induced cardiomyocyte injury n=9)

2.6 抑制miR-7a-5p表達逆轉(zhuǎn)了地佐辛對H/R誘導的大鼠心肌細胞損傷的作用

與H/R+D+anti-miR-NC組比較，H/R+D+anti-miR-7a-5p組MDA含量、細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05, 圖5, 表6)。

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷是一種復雜的多因素病理生理過程，往往伴隨著心肌細胞氧化應激和凋亡[10]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可間接反映細胞氧化應激水平[11]。SOD和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，兩者可協(xié)同作用清除自由基，保護氧化應激造成的細胞損傷[12]。本研究顯示，H/R處理后，心肌細胞H9C2中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，與相關(guān)研究報道結(jié)果一致，說明H/R可引起H9C2細胞氧化應激反應。Bcl-2和Bax蛋白是與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白，Bcl-2表達升高抑制細胞凋亡，而Bax表達升高則促進蛋白凋miRNA參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等生物學行為，在心肌疾病的發(fā)展中起重要作用[14]。研究顯示，miR-7a-5p參與帕金森氏病的發(fā)生發(fā)展，上調(diào)miR-7a-5p表達可降低多巴胺能MN9D細胞凋亡[15]。Zhi等[16]報道稱，δ-阿片受體(DOR)激活可防止缺氧/缺血性損傷，而DOR)激活上調(diào)了缺氧誘導的大鼠心臟組織中miR-7a-5p表達，提示miR-7a-5p是心臟缺氧誘導損傷的保護因子。本研究顯示，H/R處理可降低H9C2細胞中miR-7a-5p表達水平，miR-7a-5p過表達可降低H/R誘導的H9C2細胞MDA含量、細胞凋亡率及Bax蛋白表達，并提高細胞SOD和GSH-Px活力及Bcl-2蛋白表達，說明miR-7a-5p過表達可降低H/R誘導的H9C2細胞氧化應激和凋亡，靶向促進miR-7a-5p表達可能減輕心肌缺血/再灌注損傷。本研究還顯示，地佐辛干預后，H/R誘導的H9C2細胞中miR-7a-5p表達升高，而抑制miR-7a-5p表達降低了地佐辛對H/R誘導的H9C2細胞氧化應激和凋亡的抑制作用，提示地佐辛通過上調(diào)miR-7a-5p表達抑制H/R誘導的H9C2細胞氧化應激和凋亡。

Fig. 5 Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect of dizoxin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect ofdizocine on the protein expression of TRIM10, Bcl-2 and Bax in H/R-induced cardiomyocyte; B: Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect of dizocine on the apoptosis of cardiomyocyte by H/R induced

亡[13]。本研究顯示，H/R處理可提高H9C2細胞凋亡率及細胞中Bax蛋白表達，而降低Bcl-2蛋白表達，說明H/R可誘導H9C2細胞凋亡。而經(jīng)地佐辛處理后，H/R誘導的H9C2細胞MDA含量降低，SOD和GSH-Px活力升高，表明地佐辛可抑制H/R誘導的H9C2細胞氧化應激。同時，地佐辛還可降低H/R誘導的H9C2細胞凋亡率及Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達，說明地佐辛可抑制H/R誘導的H9C2細胞凋亡，保護細胞損傷。

Tab. 6 Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect ofdizocine on H/R-induced myocardial cell injury n=9)

miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，進而影響細胞的生物學行為。為了進一步探討地佐辛通過調(diào)控miR-7a-5p保護心肌細胞H/R損傷的作用機制，本研究通過生物信息學軟件與顯示，TRIM10是miR-7a-5p的靶基因，miR-7a-5p可能通過調(diào)控TRIM10表達發(fā)揮作用。本研究雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-7a-5p mimics可降低TRIM10野生型的熒光素酶活性，且上調(diào)H9C2細胞中miR-7a-5p表達后，TRIM10蛋白表達降低，而下調(diào)miR-7a-5p表達后，TRIM10蛋白表達升高，證實了miR-7a-5p在H9C2細胞中靶向負調(diào)空TRIM10表達。這也與地佐辛促進H/R誘導的H9C2細胞中miR-7a-5p的表達，而抑制TRIM10的mRNA和蛋白表達的結(jié)果一致，提示地佐辛通過上調(diào)miR-7a-5p表達進而下調(diào)TRIM10表達抑制H/R誘導的H9C2細胞氧化應激和凋亡。

綜上所述，地佐辛可降低H/R誘導的H9C2細胞氧化應激和凋亡，其可能通過調(diào)控miR-7a-5p/TRIM10軸發(fā)揮作用，具有治療心肌缺血/再灌注損傷的潛在價值。但本研究僅在細胞層面進行了初步探討，接下來將通過動物模型實驗進一步驗證地佐辛保護心肌缺血/再灌注損傷的作用并探討其可能的其他作用機制。