劉 波， 顧 燕， 羅建華， 范元碩， 馮志宇

(1. 貴州省人民醫(yī)院 內分泌科， 貴陽 550002； 2. 貴州省人民醫(yī)院 腫瘤科， 貴陽 550002)

糖尿病是全球廣泛存在的一種代謝性疾病，主要特征是由于胰島功能異常導致血糖濃度升高，加速機體消耗性損傷[1]。糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要包括糖尿病微血管病[2]，糖尿病視網膜病變[3]、糖尿病性腎病、糖尿病性壞疽[4]，糖尿病性腦血管病[5]和心血管疾病[6]。其中內皮細胞(endothelial cells，ECs)是血管系統(tǒng)的重要組成部分，內皮細胞功能異常是糖尿病性并發(fā)癥的關鍵因素[7]。

內皮細胞是血管的重要組成部分，異常的增殖和遷移都會導致血管病變的發(fā)生，進一步影響機體功能，比如視網膜病變，動脈粥樣硬化等[8]。有研究證實，持續(xù)性高糖會誘發(fā)產生機體代謝紊亂，進而影響內皮細胞損傷，加速血管病變發(fā)生。有研究報道紫草素可以激活Nrf2/HO-1信號通路下調細胞中氧化應激，減緩高糖誘導的血管內皮細胞凋亡，發(fā)揮保護作用[9]。此外郭巍巍[10]等研究發(fā)現(xiàn)，IL-35可通過調節(jié)血管內皮細胞氧自由基的水平而對抗高糖誘導的細胞凋亡[10]。但是高糖誘導內皮細胞功能異常的確切機制尚沒有明確。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA[11]。lncRNA在細胞增殖，分化，凋亡等方面發(fā)揮關鍵作用。在心血管疾病領域，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA影響內皮細胞功能直接影響心血管疾病的進展。在糖尿病大鼠中，lncRNAMALAT1的下調可抑制心肌細胞凋亡，抑制視網膜內皮細胞的增殖和遷移，減緩視網膜血管損傷炎癥反應[12]。有研究表明，lncRNAH19調控人臍靜脈內皮細胞的增殖和凋亡[13]。在卵巢癌發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)過表達可以抑制細胞凋亡[14]。雖然已有研究證實lncRNA可以調控血管內皮細胞功能發(fā)揮作用，但是lncRNA PVT1是否也可以調控內皮細胞，影響高糖誘導的細胞增殖，凋亡和氧化應激仍需要闡明。本研究主要探討了抑制lncRNAPVT1的表達對高糖誘導內皮細胞的增殖，凋亡和氧化應激的影響，旨在為糖尿病性血管疾病的治療提供確切的理論依據。

1 材料與方法

1.1 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的培養(yǎng)及分組

HUVECs購自美國ATCC公司。復蘇凍存的HUVECs細胞，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)較好的細胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min后，加培養(yǎng)基終止。用PBS輕輕吹打，制成細胞懸液。待細胞長滿瓶底75%，按照1∶2傳代，指標檢測實驗采用第4～6代細胞。實驗中主要分為四組：對照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基)，高糖組(30 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基)，高糖+siNC組(高糖組中細胞轉染陰性對照組)，高糖+siPVT1組(高糖組中細胞轉染siPVT1)。

1.2 細胞轉染及實時定量PCR(RT-PCR)檢測

選取生長狀態(tài)良好的細胞，待細胞生長至80%左右時，運用LipofectamineTM2000轉染試劑盒轉染siPVT1及siNC(陰性對照組)，分別用無血清培養(yǎng)基稀釋適量lipofectamine2000合成的RNA/質粒，輕輕混勻，靜置5 min。棄掉培養(yǎng)基，添加有血清的培養(yǎng)基，分別于轉染24 h，48 h后收集細胞，根據試劑盒說明書提取總RNA，測濃度后-80℃保存?zhèn)溆?。采用SYBR Green 法檢測PVT1的相對表達水平。引物序列由上海通用生物公司合成提供。siPVT1上游：5’-GCUUCUCCUGUUGCUGATT-3’，下游：5’-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3’；siNC上游：5’-GCUACGAUCUGCCCAAGAUTT-3’，下游：5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCTT-3’。

1.3 MTT檢測細胞增殖活力

分別選擇對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105cells/ml接種于96孔板中，每孔180 μl，設置3個復孔。37℃培養(yǎng)24 h，48 h后，吸取棄掉培養(yǎng)基。每孔加入20 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后加入150 μl DMSO溶解，輕輕震蕩，直到結晶全部溶解，用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔吸光度，吸光度越大，細胞數越多，表明細胞增殖能力越強。

1.4 流式細胞術檢測細胞ROS水平

培養(yǎng)HUVECs 24 h后，加入終濃度為10 μmol/L的H2DCFDA，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)20 min后棄掉培養(yǎng)液。PBS洗輕輕吹洗3 次，加入0.01%EDTA的胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液備用。利用FACScan流式細胞儀檢測細胞的ROS水平。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡水平

收集處理好的細胞，1×PBS洗3次后加入800 μl PBS制成懸液，置于1.5 ml EP管中，避光條件下分別加入5 μl Annexin V及5 μl PI，輕輕混勻，室溫條件避光反應20 min，上流式細胞儀檢測凋亡率，凋亡率=壞死細胞數/總細胞數×100%

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞凋亡相關蛋白的表達水平

收集細胞，1×PBS洗3次，加入RIPA裂解液提取蛋白，冰上裂解細胞30 min后，4℃低溫高速離心，12 000 r/min，離心10 min，取上清備用。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，添加上樣緩沖液，稀釋為均一濃度，99℃金屬浴加熱5 min變性。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉模，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，加入稀釋后的一抗(Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；cleaved-caspase-3， 1∶1 000； GAPDH，1∶900)，4℃過夜孵育。1×TBST洗脫3 次，每次8 min，室溫孵育HRP標記的二抗(抗兔，1∶10 000稀釋)1 h，1×TBST洗脫3 次，每次8 min，ECL法暗室顯影，應用凝膠成像分析儀測定蛋白條帶灰度值，其中GAPDH為內參。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 轉染后siPVT1后HUVECs細胞中PVT1的表達水平

實時定量PCR結果顯示，和control+siNC組(0.78±0.19)比較，轉染組中PVT1(0.37±0.07)的表達水平明顯下調(P<0.01)，結果表明siPVT1轉染成功。

2.2 siPVT1對高糖誘導的HUVECs細胞增殖能力的影響

MTT結果顯示(表1)，和對照組比較培養(yǎng)24 h和48 h后高糖組中HUVECs細胞增殖活力顯著降低(P<0.05)。轉染siPVT1后，與HG+siNC組比較，培養(yǎng)24 h和48 h后，HG+siPVT1組中HUVECs細胞增殖活力顯著增加(P<0.05)。結果表明，siPVT1可以增加高糖誘導HUVECs細胞增殖活力。

Tab. 1 The effects of siPVT1 on hyperglycemia-induced proliferation activity of HUVECs cells n=3)

2.3 siPVT1對高糖誘導的HUVECs細胞氧化應激和凋亡的影響

流式細胞術結果顯示(表2, 圖1)，與對照組比較，高糖誘導的HUVECs細胞氧化應激和凋亡率均顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與轉染組比較，HG+siPVT1組中細胞氧化應激水平顯著減少，凋亡率也顯著降低(P<0.05)。結果表明，siPVT1可以減少高糖誘導的HUVECs細胞的氧化應激，抑制細胞凋亡。

Tab. 2 The effects of siPVT1 on oxidative stress and apoptosis induced by hyperglycemia in HUVECs cells (%， n=3)

Fig. 1 Comparison of apoptosis in HUVECs in each group

2.4 siPVT1對高糖誘導的HUVECs凋亡相關蛋白的影響

采用Western blot檢測，結果顯示，與對照組比較，高糖組中Bax和cleaved-caspase-3表達水平均顯著上調，Bcl-2表達顯著下調(表3，圖2，P< 0.05)。與HG+siNC組比較，HG+siPVT1組中HUVECs細胞中Bax和cleaved-caspase-3表達顯著下調，Bcl-2表達顯著增加(P<0.05)。

Tab. 3 Protein expressions of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in HUVECs induced by hyperglycemia n=3)

Fig. 2 Comparison of the expressions of apoptosis-related proteins in HUVECs in each group

3 討論

隨著生活水平的提高，糖尿病是現(xiàn)代社會發(fā)病率極高的一種代謝性疾病，伴隨著并發(fā)癥發(fā)病率增加，死亡率也逐年增加，因此研究糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制具有重要意義[15]。其中糖尿病血管病變是發(fā)病率最高的一類疾病，內皮細胞在高糖環(huán)境下的功能障礙被認為是糖尿病性血管病變的關鍵影響機制[16]。有研究表明，高糖環(huán)境下內皮細胞增殖能力下降，凋亡增加直接導致內皮功能異常，間接加重血管炎癥發(fā)生[9]。此外有研究表明，內皮細胞凋亡是早期血管病變的關鍵啟動步驟[17]。

lncRNA對于細胞功能的調控更加精細，已有的研究顯示，lncRNA參與了染色質沉默、基因組印記等關鍵的生理過程[18，19]。此外lncRNA 與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，參與調控血管生成，腫瘤細胞侵襲，凋亡等的發(fā)展。 lncRNA PVT1位于原癌基因 MYC下游，已被證明與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，具有癌基因的作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)， lncRNA-PVT1可以促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，那么PVT1是否可以影響內皮細胞的增殖和凋亡，參與血管病變的發(fā)展尚不十分清楚。因此本文主要采用轉染siPVT1至HUVECs細胞中探討抑制lncRNA PVT1對高糖誘導的HUVECs細胞增殖，氧化應激和凋亡的影響。

本實驗中首先采用細胞轉染siPVT1和siNC，RT-PCR結果證實PVT1表達顯著降低，轉染成功。MTT法檢測siPVT1對高糖誘導的HUVECs細胞增殖能力的結果提示，siPVT1明顯促進高糖誘導的細胞增殖。流式細胞術檢測細胞凋亡和氧化應激的結果表明，lncRNA PVT1沉默可以顯著抑制細胞凋亡和氧化應激。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡蛋白[21]。Western blot蛋白表達水平的結果顯示，siPVT1可以顯著下調高糖誘導條件HUVECs細胞中Bax和cleaved-caspase-3的表達，上調Bcl-2的表達水平。據此推測高糖誘導的血管內皮細胞中會產生大量氧自由基，細胞啟動自我保護機制，加速抗氧化酶的合成和分泌。在氧化應激大范圍發(fā)生時，Bax等促凋亡蛋白也會同時被激活，加速細胞凋亡，高糖持續(xù)刺激可以進一步加劇血管內皮細胞內氧化應激及凋亡。本實驗提示，沉默PVT1的表達可以抑制高糖環(huán)境下內皮細胞的凋亡和氧化應激，促進增殖，減輕內皮細胞損傷。有關siPVT1在高糖誘導的內皮細胞中抗氧化應激和抗凋亡的分子機制尚有待進一步研究。

總之，由于內皮細胞在持續(xù)高糖環(huán)境下發(fā)生的功能異常導致血管病變的發(fā)生，這提示我們將保護內皮細胞作為治療策略，降低糖尿病并發(fā)癥，提高患者生活質量。我們的研究提供了一種治療糖尿病血管病變的新策略，可以將PVT1作為潛在的靶基因，抑制內皮細胞凋亡，保護內皮細胞功能，這對未來尋找防治糖尿病并發(fā)血管病的措施具有重要指導意義。