丁 璐， 邵淑麗,2△， 何孟奇， 黃 鑫,2， 張偉偉,2， 張珍珠,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

全球每年有超過100萬人死于胃癌，其病死率位居全球腫瘤死亡率的第二位[1]。由于大多部分胃癌患者病情發(fā)現(xiàn)時(shí)已至中晚期，無法接受手術(shù)治療，所以臨床上通常使用化療手段治療中晚期患者[2]。目前，對(duì)于胃癌中晚期患者主要使用多西他賽、紫杉醇、替吉奧、伊立替康等化療藥物，但有研究顯示，此類藥物具有較大的毒副作用,可促使腫瘤細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)，降低部分患者的生存率[3]。近年來發(fā)現(xiàn)一些天然藥物成分可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療腫瘤的效果，并且這些藥物具有毒副作用小，治療效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，川楝素、白花蛇舌草等天然藥物具有抗腫瘤細(xì)胞增殖與促腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[4,5]。樺木酸作為一種天然存在的三萜類化合物，廣泛分布于多種植物中，具有抗炎、抗微生物等生物活性，并且可用于治療心腦血管以及動(dòng)脈硬化等方面的疾病[6]。研究表明，樺木酸能夠通過使癌細(xì)胞自然死亡從而實(shí)現(xiàn)抗癌的作用[7]，其可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖，并使其細(xì)胞周期停滯于G0/G1期[8]。此外，樺木酸可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的凋亡，并且抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。然而樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究尚鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后對(duì)其凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，探討樺木酸是否誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，為天然藥物樺木酸在胃癌臨床治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Iudustries公司；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；RNA提取試劑盒以及蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工有限公司；Bax、Bcl-2與Caspase-3一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗購(gòu)自美國(guó)LI-COR有限公司；Power 2×SYBR real-time PCR premixture試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；IP細(xì)胞裂解液盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；樺木酸購(gòu)自北京漢博生物有限公司；吖啶橙購(gòu)自上海伊卡生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

將購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所的人胃癌SGC-7901細(xì)胞放入含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每500 ml培養(yǎng)基中加入0.05 g青霉素0.06 g與鏈霉素，將其置于CO2濃度為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用孔徑為0.02 μm的濾器過濾樺木酸溶液，分別配置成濃度為 10 mg/L、20 mg/L及30 mg/L 的樺木酸溶液，分裝并保存在4℃冰箱中。在人胃癌SGC-7901細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將其分為4組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組未加入樺木酸，而三組實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10 mg/L、20 mg/L及30 mg/L的樺木酸，將各組細(xì)胞放入5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)

在人胃癌SGC-7901細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后，將爬片置于六孔板中并接種人胃癌SGC-7901細(xì)胞，在細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別加入終濃度為0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L及30 mg/L的樺木酸，在含有5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后。用2 ml 的PBS洗滌爬片，再用1 ml的4%多聚甲醛固定人胃癌SGC-7901細(xì)胞20 min，PBS洗滌爬片，向爬片中央滴加500 μl 吖啶橙，孵育10 min，PBS洗滌爬片，在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并且拍照。

1.4 AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將用濃度為0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的樺木酸處理48 h后的人胃癌SGC-7901細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后4℃離心5 min，收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后4℃離心5 min，用1× Binding Buffer懸浮細(xì)胞成濃度為1× 106細(xì)胞懸液，在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin VEGFP，輕輕混勻后避光孵育15 min，再加入10 μl PI混勻后避光孵育5 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位

收集用0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的樺木酸處理48 h后的人胃癌SGC-7901細(xì)胞于0.5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒混合數(shù)次，將其置于含有5%的 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育30 min，同時(shí)將5× JC-1染色緩沖液稀釋為1× JC-1染色緩沖液，放置于冰上，孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液1 500 r/min離心3 min，棄上清，用1× Incubation Buffer洗滌細(xì)胞2次，最后用500 μl的1× Incubation Buffer重懸，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的mRNA水平

將對(duì)照組以及用10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的樺木酸處理過的人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用Trizol吹下，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別設(shè)計(jì)Bcl-2、Bax和Caspase-3的PCR引物(表1)，內(nèi)參為β-actin，每組設(shè)置三組重復(fù)，依據(jù)熒光定量染料法試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。最后得到的Ct值采用2-△△ct計(jì)算，分別計(jì)算Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.7 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的蛋白水平

將未用樺木酸處理過以及用10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的樺木酸處理過的人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰酶將細(xì)胞消化，加裂解液，離心，取沉淀，并提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，4℃一抗孵育過夜，用PBST緩沖液將PVDF膜洗滌3遍，二抗避光孵育2 h后，用PBST洗滌3遍后用ECL顯色，曝光。使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以β-actin蛋白水平作為參照，計(jì)算凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響

用吖啶橙染色正常人胃癌SGC-7901細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖1(A)呈現(xiàn)均勻一致的綠色熒光，大小均勻一致，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞膜完整以及分裂狀態(tài)正常。而用不同濃度樺木酸(10、20、30 mg/L)處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)如圖1(B、C、D)所示，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核裂解的情況，并且胞膜上有小泡狀形成，并且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞核裂解情況越明顯。

Fig. 1 Cell morphology of SGC-7901 cells treated with betulinic acid for 48 h under a laser confocal microscope(acridine orange ×200， n=3)A： 0 mg/L； B： 10 mg/L； C： 20 mg/L； D： 30 mg/L

2.2 不同濃度樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

不同濃度的樺木酸作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為5.5%±0.3%，而當(dāng)樺木酸濃度為10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L時(shí)，細(xì)胞早期凋亡率分別為36.1%±0.5%，54.7%±0.7%和30.1%± 0.4%。與對(duì)照組相比，隨著樺木酸濃度的增加，人胃癌SGC-7901細(xì)胞均有不同程度的凋亡現(xiàn)象(P< 0.05，P<0.01)，而20 mg/L的處理組與10 mg/L和30 mg/L相比，細(xì)胞凋亡程度更為明顯(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Detection of apoptosis rate of SGC-7901 cells (%， n=3)

2.3 不同濃度樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響

用不同濃度樺木酸作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)線粒體膜電位的影響，結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組細(xì)胞線粒體膜電位為99.80±0.02，而用濃度為10、20、30 mg/L的樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的線粒體膜電位分別為81.80±1.12 、13.00±0.94 、70.00±1.03，與對(duì)照組相比，隨著樺木酸濃度的增加，線粒體膜電位均有不同程度的降低(P<0.05，P<0.01)，與藥物濃度為10 mg/L 、30 mg/L的處理組相比，當(dāng)樺木酸濃度為20 mg/L時(shí)，線粒體膜電位降低較為顯著(P<0.01，表3)。

Tab. 3 Detection of mitochondrial membrane potential and Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA expressions in SGC-7901 cells n=3)

2.4 不同濃度樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)不同濃度樺木酸作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，用濃度為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，Bcl-2基因的 mRNA表達(dá)均有不同程度的下降(P< 0.01)，在樺木酸濃度為 20 mg/L 時(shí)其mRNA表達(dá)最低，而Bax、Caspase-3基因的mRNA表達(dá)均有不同程度的上升(P<0.01)，在樺木酸濃度為 20 mg/L 時(shí)，Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)最高(圖2，表2)。

Fig. 2 Effect of betulinic acid on mRNA expressions of apoptosis-related genes in human gastric cancer SGC-7901 cells (n=3)A： Relative mRNA expression of Bcl-2； B： Relative mRNA expression of Bax； C： Relative mRNA expression of Caspase-3**P<0.01 vs 0 mg/L； #P<0.05，##P<0.01 vs 10 mg/L； △P<0.05，△△P<0.01 vs 30 mg/L

2.5 不同濃度樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)不同濃度樺木酸作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，其凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)樺木酸濃度為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L時(shí)， Bcl-2蛋白表達(dá)均有不同程度的降低(P<0.01)，在藥物濃度為20 mg/L時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)最低，而Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)均有不同程度的升高(P<0.01)，在藥物濃度為20 mg/L時(shí)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)最高(圖3，表4)。

Fig. 3 Effect of betulinic acid on protein expressions of apoptosis-related genes in human gastric cancer SGC-7901 cells (n=3)A： Relative protein expression of Bcl-2； B： Relative protein expression of Bax； C： Relative protein expression of Caspase-3**P<0.01 vs 0 mg/L； #P<0.05，##P<0.01 vs 10 mg/L； △P<0.05，△△P<0.01 vs 30 mg/L

Tab. 4 The effects of betulinic acid on protein levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3 n=3)

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的惡性腫瘤之一[10],臨床上常用順鉑，五氟尿嘧啶等化學(xué)藥物進(jìn)行化療，但往往會(huì)產(chǎn)生較大的毒副作用[11]，因此尋找有效且毒副作用小的化療藥物是改進(jìn)胃癌治療現(xiàn)狀的迫切需要。許多天然物質(zhì)具有抗腫瘤的能力，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。盡管這些天然藥物在臨床使用上取得進(jìn)展，但目前臨床上仍面臨著缺少毒副作用小且治療效率高的化療藥物的問題。樺木酸又名白樺脂酸，主要存在于樺木屬植物當(dāng)中，同時(shí)也存在于其他多種植物中，其在白樺樹樹皮當(dāng)中的含量最高。研究表明，樺木酸具有抗感染，增強(qiáng)血管生成，減輕細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激和激活自噬等作用[12，13]。同時(shí)，樺木酸又具有抗腫瘤的能力，Ye等人發(fā)現(xiàn)樺木酸以及其衍生物對(duì)黑色素瘤、胃癌、卵巢癌以及宮頸癌具有明顯的抑制作用，用不同濃度的樺木酸衍生物處理黑色素瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞均受到不同程度的抑制，隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡情況越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性[14]。與傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物相比，樺木酸較絕大多數(shù)化療法更為有效，尤其是在腫瘤復(fù)發(fā)治療中具有顯著效果，且樺木酸不會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞造成傷害，也不會(huì)與其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥性[15]。本研究使用0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L濃度的樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后并檢測(cè)其凋亡情況，探討樺木酸是否可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各處理組細(xì)胞凋亡程度均較為明顯，且當(dāng)藥物濃度為20 mg/L時(shí)，細(xì)胞凋亡情況最為明顯。

細(xì)胞凋亡屬于細(xì)胞的程序性死亡[16]，作為最早已知的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的形式，細(xì)胞凋亡可通過兩種不同的途徑發(fā)生，即Caspase 無關(guān)途徑和Caspase 依賴途徑。Caspase 無關(guān)途徑包括兩個(gè)主要因素，即凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和內(nèi)切酶G(EndoG)：前者在進(jìn)入細(xì)胞核后促進(jìn)染色質(zhì)凝聚和細(xì)胞核碎裂，后者通過直接消化細(xì)胞核內(nèi)的DNA從而起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Caspase 依賴途徑可以通過內(nèi)在發(fā)生線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，分別以Caspase-9和Caspase-8的激活為標(biāo)志[17]。有研究表明，Bcl-2、Bax作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制，可調(diào)節(jié)線粒體的通透性，Bcl-2過表達(dá)后可阻斷Cyt-C的釋放，抑制Caspase 的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡，而Bax的作用則與Bcl-2相反[18]。在本研究中，用濃度為10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L的樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，線粒體膜電位均有不同程度的降低且細(xì)胞凋亡率明顯增加，同時(shí)qRT-PCR 與Western blot結(jié)果顯示，用不同濃度樺木酸處理48 h后，與對(duì)照組相比，Bax與Caspase-3的表達(dá)量均有不同程度升高，而Bcl-2則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。以上結(jié)果提示當(dāng)樺木酸藥物濃度增加后，可能會(huì)激活Bcl-2/Bax與Caspase-3凋亡相關(guān)途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與增加Bax/Bcl-2比值和上調(diào)Caspase-3可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的結(jié)果相一致[19]。

綜上所述，樺木酸可上調(diào)Bax與Caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。由于樺木酸相對(duì)于其他天然藥物更容易通過化學(xué)方法合成，價(jià)格又較為低廉，所以本研究結(jié)果可為其在腫瘤臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。