陸潤(rùn)蘭， 李 萍， 李 兵， 邢 媛， 張媛媛， 陳斌澤， 胡秦妮， 楊志華， 高保東，哈小琴， 高彩燕△

(1. 蘭州市中醫(yī)醫(yī)院， 蘭州 730050; 2. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院， 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730050)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種以高血糖和胰島素抵抗為主要特征的慢性代謝性疾病。研究顯示，高原地區(qū)2型糖尿病患者血液學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變，易發(fā)生血管病變[1]。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的原始細(xì)胞對(duì)血管的修復(fù)以及個(gè)體的整個(gè)生命周期都起著至關(guān)重要的作用。研究顯示，T2DM患者隨著血管并發(fā)癥的加重，循環(huán)EPCs數(shù)量降低，功能發(fā)生異常[2]。而且隨著海拔的升高，HIF-1α表達(dá)增加，循環(huán)EPCs數(shù)量降低[3]。但目前仍不清楚不同海拔下T2DM患者外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量變化和HIF-1α的表達(dá)情況。據(jù)此，本文將對(duì)不同海拔下T2DM及并發(fā)癥患者外周血EPCs和HIF-1α的變化進(jìn)行分析，從而為高海拔地區(qū)T2DM患者血管并發(fā)癥的治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取長(zhǎng)居海拔386 m的陜西省咸陽(yáng)市某醫(yī)院的2型糖尿病患者25名，健康者20名，作為低海拔組；選取長(zhǎng)居海拔1 520 m的甘肅省蘭州市某醫(yī)院的2型糖尿病患者29名，健康者20名，作為高海拔組。納入排除標(biāo)準(zhǔn)：2型糖尿病患者以2003年世界衛(wèi)生組織 T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，排除糖尿病合并心腦血管疾病、肝臟、腎臟、呼吸系統(tǒng)疾病，以及近期手術(shù)、炎癥、腫瘤、外傷、潰瘍病等影響EPCs的患者；健康對(duì)照組分別來自該院同期健康體檢無任何異常者。

1.2 體格檢查

對(duì)納入對(duì)象均測(cè)量血壓、身高、體重、腰圍和臀圍，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)和腰臀比(waist to hip ratio, WHR)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(1)生化指標(biāo)檢測(cè) 采集受試者5 ml靜脈血，進(jìn)行臨床常規(guī)生化檢測(cè)。

(2)循環(huán)EPCs的檢測(cè) 取受試者200 μl抗凝全血，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的人CD45單克隆抗體，堿性磷酸酶(alkaline phosphotase，AP)標(biāo)記的人CD34單克隆抗體和藻紅蛋白(R-Phycoerythrin, PE)標(biāo)記的人 VEGFR-2(KDR)單克隆抗體各5 μl，再加入別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin, APC)標(biāo)記的IgG和PE標(biāo)記的IgG單克隆抗體來做同型對(duì)照熒光補(bǔ)償。25℃避光孵育30 min。后加入7 ml紅細(xì)胞裂解液，避光分解20 min，裂解完全后以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清，加磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)液洗滌2次(每次2 ml)，全部轉(zhuǎn)入BD流式管中離心5 min，棄上清，加入500 μl PBS制成單細(xì)胞懸液。最后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)每個(gè)樣本中CD45，CD34和VEGFR-2(KDR)雙陽(yáng)性的細(xì)胞即為EPCs，并以1×106單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(3)HIF-1α的濃度檢測(cè) 血清中HIF-1α濃度采用ELISA方法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 基本信息

兩地共納入糖尿病者54人，健康者40人，男女各半，均為漢族，年齡為(59.5±9.9)歲。其中T2DM患者按照有無血管并發(fā)癥分為T2DM無血管并發(fā)癥組，T2DM大血管并發(fā)癥組以及T2DM微血管并發(fā)癥組。不同海拔地區(qū)研究對(duì)象基本信息詳見表1。

Tab. 1 General situation of included objects in different altitude groups[n(%)]

2.2 不同海拔下T2DM組和健康組檢測(cè)指標(biāo)分析

如表2，3所示，無論高、低海拔地區(qū)，糖尿病組較健康組的BMI、WHR、GLU、HbAlc、TG均升高，而LDL降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EPCs數(shù)量也較健康組減少(P<0.01)，提示糖尿病患者較健康者脂含量和糖含量較高，血管損傷修復(fù)的能力不如健康者；HIF-1α水平高海拔組較低海拔組明顯增高(P<0.05)，低海拔糖尿病患者和健康者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說明高海拔下機(jī)體缺氧程度高于低海拔，而高海拔T2DM缺氧較健康者更為嚴(yán)重。

Tab. 2 Analysis of the detection indexes and the number of EPCs in type 2 diabetes and healthy groups in low altitude areas

Tab. 3 Analysis of the detection indexes and EPCs of type 2 diabetes and healthy groups in high altitude areas

2.3 不同海拔下血糖控制好壞狀況對(duì)T2DM組循環(huán)EPCs的數(shù)量的影響

如表4所示。血糖控制良好者空腹血糖較血糖控制較差者低(P<0.05)；循環(huán)EPCs數(shù)量較高(P<0.05)。提示血糖控制良好者較控制較差者，體內(nèi)糖毒性引起血管損傷的程度更低，血管的修復(fù)能力更強(qiáng)。因此嚴(yán)格的控制血糖對(duì)于血管的修復(fù)具有重要意義。

Tab. 4 The effects of high and low altitude blood glucose control on the number of circulating EPCs in T2DM patients

2.4 不同海拔下各T2DM血管并發(fā)癥組和健康組循環(huán)EPCs的數(shù)量變化情況

如圖1所示，低海拔組的健康者、T2DM無血管病變者、T2DM大血管病變者和T2DM微血管病變者循環(huán)EPCs數(shù)量均高于高海拔組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這提示高海拔缺氧環(huán)境下，EPCs的動(dòng)員能力或細(xì)胞的存活能力下降；其循環(huán)EPCs數(shù)量由高至低依次為健康組、T2DM無血管并發(fā)癥者、T2DM微血管并發(fā)癥者，T2DM大血管并發(fā)癥者與T2DM微血管并發(fā)癥者無差別，即除T2DM大小血管病患者之間循環(huán)EPCs數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其他各組之間兩兩比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此結(jié)果同樣提示隨糖尿病并發(fā)癥的加重體內(nèi)可動(dòng)員的EPCs數(shù)量或存活的數(shù)量逐漸降低，對(duì)于血管的修復(fù)能力也逐漸降低。因此EPCs的數(shù)量與海拔和疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

Fig. 1 Changes in the number of Log(EPCs) between groups ofhigh and low altitude groupsA: Healthy group; B: T2DM without avascular disease group; C: T2DM macrovascular disease group; D: T2DM microvascular disease group*P<0.05 vs low altitude group

3 討論

T2DM的大小血管并發(fā)癥因起病隱匿，發(fā)生率高，而患者知曉率，診斷率和治療率低，危害性大等特點(diǎn)，使得血管并發(fā)癥致殘或致死的發(fā)生率亦在逐年上升[4]。研究顯示，糖尿病患者的胰島素抵抗和高血脂高血糖狀態(tài)對(duì)EPCs的增殖、分化、歸巢及整合入血管的所有功能均有損害[5]。因此對(duì)于EPCs的測(cè)定可在一定程度上反應(yīng)糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展情況。EPCs目前的測(cè)定方法較多，本文采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)量的測(cè)定，能夠更加靈敏和特異性的量化循環(huán)EPCs的數(shù)量。

本研究結(jié)果顯示糖尿病組較健康組循環(huán)EPCs數(shù)量減少，且與并發(fā)癥的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。這可能與以下幾種機(jī)制相關(guān)。第一，糖尿病患者長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，從而誘發(fā)(advanced glycation end products，AGEs)的產(chǎn)生增加，抑制了EPCs的數(shù)量，影響其功能[6]。第二，高糖會(huì)使內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性降低，從而使NO的分泌減少，影響血管功能和EPCs的生成。相關(guān)的研究已證實(shí)高糖狀態(tài)會(huì)抑制PI3K/Akt/eNOS通路的表達(dá)，從而影響NO的合成來影響EPCs的動(dòng)員[7],而且NO還能通過多種途徑來影響EPCs的動(dòng)員，影響血管的生成。而在其通路調(diào)節(jié)的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能影響著EPCs的數(shù)量和功能[8]。第三，高糖引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)，活性氧產(chǎn)生增加，加速EPCs的衰老[9]，且會(huì)增加EPCs的自噬和凋亡，使細(xì)胞數(shù)量減少[10]。但糖尿病患者因自噬導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少的具體通路還未完全探明，還需進(jìn)一步證實(shí)。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)而言，研究對(duì)象血循環(huán)EPCs減少。這為高海拔地區(qū)糖尿病患者進(jìn)行EPCs移植進(jìn)行治療成為可能。因隨海拔的升高，機(jī)體缺氧加重，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，出現(xiàn)血紅素加氧酶表達(dá)降低，引起EPCs衰老和功能障礙[11]。在急性缺氧的情況下，EPCs會(huì)大量移植到外周血，組織血運(yùn)重建；在慢性缺氧的情況下，HIF-1α?xí)鷥斝缘母弑磉_(dá)刺激下游因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)，血管生成素1/2(angiopoietin1/2，ANGPT1/2)等多種血管生成因子的表達(dá)，來促進(jìn)組織對(duì)缺氧的反應(yīng)，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷[12]，而被激活的ANGPT又進(jìn)一步增強(qiáng)EPCs的增殖和遷移，從而導(dǎo)致排列良好的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間連接的血管增大，促進(jìn)血液灌注[13]。Zhou[14]的研究也證實(shí)HIF-1α還可直接參與低氧誘導(dǎo)的EPCs增殖，遷移和分化。而且Zan[15]也提出了HIF-1α調(diào)控EPCs的兩種途徑，一方面HIF-1α通過SDF-1 / CXCR4軸促進(jìn)EPCs動(dòng)員和歸巢，來增加外周血中的EPCs數(shù)量，助力新血管形成。另一方面，它可以通過刺激VEGF，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等的表達(dá)來改善EPC的血管生成功能，而此時(shí)遷移能力與外周血中的細(xì)胞數(shù)量是相反的，這就可以很好地解釋為什么高海拔或者并發(fā)癥嚴(yán)重的時(shí)候，HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)而EPCs的數(shù)量降低了。因?yàn)檫M(jìn)入失代償階段后，HIF-1α表達(dá)不斷增強(qiáng)，刺激著EPCs的遷移，但EPCs動(dòng)員減少或存活下降，沒有有效的歸巢，受損的血管得不到很好的修復(fù)，使其血管病變加重[16]。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)血糖控制良好的患者較血糖控制較差的相比循環(huán)EPCs數(shù)量較高，這與Churdchomjan等人[17]的研究結(jié)果相一致，這也在一定程度上說明只要很好地控制血糖將在并發(fā)癥的預(yù)防和預(yù)后中起到重要作用。但這只是從橫斷面水平研究的結(jié)果，仍需要進(jìn)行隊(duì)列研究來證明控制血糖控制良好是否能夠改善外周EPCs進(jìn)而預(yù)防血管并發(fā)癥。

總之，本研究結(jié)果提示T2DM患者與健康者相比循環(huán)EPCs數(shù)量減少且與疾病程度相關(guān)；高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)人群循環(huán)EPCs數(shù)量顯著減少，HIF-1α高度表達(dá)。這將為高海拔地區(qū)T2DM患者進(jìn)行EPCs移植，緩解糖尿病并發(fā)癥提供依據(jù)。