史華彩， 陳 睿， 佘燕玲， 周珊瑤， 雷 斯， 郭 雋

(廣東省第二人民醫(yī)院， 廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運動傷害康復(fù)研究所， 廣州 510317)

肢體制動是一種常用的治療手段，在臨床上常用夾板、石膏等限制患肢活動，防止骨折或其他創(chuàng)傷發(fā)生繼發(fā)性損傷，有利于康復(fù)，但長時間或者不合理的制動會引起患肢肌肉周圍神經(jīng)傳導(dǎo)減慢、局部血供減少、關(guān)節(jié)活動度下降等，從而導(dǎo)致肌肉萎縮。另外，肌肉萎縮也會影響患肢功能恢復(fù)、肌力、耐力，嚴(yán)重者會影響患者的日常生活，降低生活質(zhì)量，加重家庭甚至社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1, 2]。因此尋找預(yù)防及治療骨骼肌萎縮的靶點具有重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs，lncRNAs)是一類從不完全注釋基因上轉(zhuǎn)錄出來的，長度大于200個核苷酸，幾乎無編碼能力的RNA[3,4]，參與了骨骼肌纖維的形成和穩(wěn)態(tài)等過程[5,6]。Atrolnc-1是一種與肌萎縮相關(guān)的lncRNA，由Lijing Sun等在慢性腎病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，并認(rèn)為Atrolnc-1與A20 binding inhibitor of NF-κB-1(ABIN-1)相互作用，激活NF-κB，促進(jìn)MuRF-1表達(dá)增強(qiáng)[7]。

本研究主要探討Atrolnc-1在制動誘導(dǎo)小鼠后肢肌萎縮中的作用，為其用于臨床治療長期臥床、石膏固定、缺少運動等引起的肌萎縮提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6周齡雄性C57BL/6小鼠20只，SPF級，體量18～22 g，購買于中山大學(xué)實驗動物中心，并飼養(yǎng)于廣州永諾生物科技有限公司。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對照組(Control)和制動組(Immobilization)，每組10只。本研究對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 實驗儀器和試劑

電子秤，上海菁海儀器有限公司；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像，上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀，美國ABI公司；電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，北京凱元信瑞儀器有限公司。

蘇木素和伊紅，廣州市凱秀貿(mào)易有限公司；VDAC抗體，美國CST公司；Atrogin-1(muscle atrophy F-box，Atrogin-1)抗體、MuRF-1(muscle ring finger protein-1，MuRF-1)抗體，英國Abcam公司；p-NF-κB抗體、Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔，美國Abclonal公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒，德國Millipore公司。

1.3 動物制動模型的建立

對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何實驗處理。制動組：采用10 mg/ml戊巴比妥鈉0.2 ml腹腔注射麻醉后，將小鼠右側(cè)后肢裝入自制塑料制動器，調(diào)節(jié)使之固定，密切注意觀察動物肢體的末梢血液循環(huán)及制動器固定情況，若發(fā)現(xiàn)有水腫或制動器松脫，立即中止該動物的實驗。制動組小鼠的飼養(yǎng)及環(huán)境條件同對照組。制動2周后[8]，將2組小鼠麻醉取材后處死，用于形態(tài)學(xué)觀察、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，QRT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot，WB)檢測。

1.4 取材

麻醉小鼠，于動物實驗操作臺上仰臥位固定其四肢。取右后肢下段背側(cè)，切開皮膚，分離腓腸肌并切斷，完整取下，剔除筋膜，用PBS沖洗殘留的血液，并用滅菌紗布吸干，稱取濕重。將組織切成2份，一部分迅速投入液氮后保存在-80℃冰箱，另一部分置于10%中性福爾馬林固定液中固定。

1.5 蘇木素-伊紅(HE) 染色

取10%中性福爾馬林固定液中固定的樣本進(jìn)行組織修剪、常規(guī)脫水，石蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成5 μm大小的薄片。用二甲苯脫蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水。用蘇木素染色5 min，再用1%鹽酸乙醇分化3 s。流水沖洗30 s后入蒸餾水片刻，再入70%和90%酒精中脫水各10 min。用0.5%伊紅染細(xì)胞漿3 min，蘇木素染核。滴上中性樹脂，蓋上蓋玻片封固。最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.6 肌纖維橫截面積測定

經(jīng)HE染色后，每個樣本取5張切片，于200倍放大倍數(shù)鏡下，各采集10張圖像，所得圖像用Image J軟件分析肌纖維橫截面積，并計算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 QRT-PCR檢測Atrogin-1、Atrolnc-1的表達(dá)水平

用Trizol提取腓腸肌總RNA，核酸蛋白定量儀檢測RNA的濃度。取總RNA 2 μl，按照Takara試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。檢測Atrogin-1、Atrolnc-1的表達(dá)，記錄Ct值，以18 s為內(nèi)參，計算2-△△Ct。上下游引物序列見表1。

Tab. 1 Sequences of PCR primers

1.8 蛋白提取定量

從-80℃冰箱取出組織置于無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將肌肉剪碎至肉糜狀，分成兩份：一份加入裂解液于冰上裂解0.5 h，隨后用電動勻漿器進(jìn)一步勻漿，使其完全裂解，12 000 r/min，4℃，15 min離心，上清液轉(zhuǎn)至Eppendorf管中，得到總蛋白；另一份行核質(zhì)分離，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的步驟操作，最后得到細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白。用BCA法蛋白定量，余下樣品加入相應(yīng)體積的6×SDS Loading Buffer，100℃煮沸5 min。

1.9 Western blot檢測p-NF-κB、Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平

采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGF)進(jìn)行電泳，每個上樣孔中加入40 μg蛋白樣本。開始電泳時，電壓為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，增加電壓至120 V，電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部。拆膠，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，取膜，浸入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床封閉1 h，然后加入p-NF-κB抗體(1∶1 000)，Atrogin-1抗體(1∶1 000)，MuRF-1抗體(1∶1 000)，Tubulin抗體(1∶5 000) ，VDAC抗體(1∶1 000)，于4℃孵育過夜。用TBST液洗膜3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。Image J分析蛋白條帶灰度值，以Tubulin、VDAC作為內(nèi)參[9]，目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比表示相對蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 制動對小鼠腓腸肌的影響

兩組小鼠的體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，制動組小鼠腓腸肌濕重減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腓腸肌的濕重/體重千分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示小鼠制動后，腓腸肌出現(xiàn)萎縮(表2)。

Tab. 2 Comparison of body weight and gastrocnemius wet weight in each n=10)

2.2 腓腸肌形態(tài)學(xué)改變及肌纖維橫截面積測定

兩組腓腸肌經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示：對照組肌細(xì)胞呈圓形或橢圓形，邊緣規(guī)則，形態(tài)清晰，肌絲排列整齊有序，未見炎癥細(xì)胞、充血等。制動組見骨骼肌纖維邊緣不規(guī)則，大量肌纖維縮小或溶解，結(jié)構(gòu)不清，肌纖維橫紋排列紊亂，間質(zhì)見炎癥細(xì)胞浸潤，部分血管擴(kuò)張充血(圖1A)。

肌纖維橫截面積測定結(jié)果顯示，對照組的肌纖維橫截面積為(3881±379.3)μm2，制動組的肌纖維橫截面積為(2725±181.7)μm2，制動后肌纖維橫截面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示小鼠腓腸肌萎縮(圖1B)。

Fig. 1 Morphological changes of gastrocnemius and the cross-sectional area of muscle fiber (n=10)A： Morphological changes of gastrocnemius between control group and immobilization group(HE staining，original magnification ×200，scale bar=200 μm)； B： The cross-sectional area of muscle fiber between control group and immobilization group(μm2)**P<0.01 vs control group

2.3 制動后Atrogin-1 mRNA及蛋白的變化情況

結(jié)果顯示，QRT-PCR檢測Atrogin-1 mRNA表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2A)。WB檢測Atrogin-1蛋白表達(dá)也升高(P<0.01)。提示小鼠制動2周后，腓腸肌萎縮(圖2B、表3)。

Tab. 3 The level of Atrogin-1 protein in each n=3)

Fig. 2 The mRNA and protein levels of Atrogin-1 after immobilization(n=10)A： The level of Atrogin-1 mRNA； B： The level of Atrogin-1 protein**P<0.01 vs control group

2.4 制動后Atrolnc-1、p-NF-κB蛋白、MuRF-1蛋白的變化情況

結(jié)果顯示，制動2周后，Atrolnc-1的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3A)；胞漿p-NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，但胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.01)(圖3B、C，表4)，同時MuRF-1表達(dá)也升高(P<0.01)(圖3D，表4)。提示制動誘導(dǎo)腓腸肌萎縮，其機(jī)制可能是Atrolnc-1激活NF-κB，促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核，從而上調(diào)MuRF-1的表達(dá)。

Fig. 3 The expressions of Atrolnc-1 and the protein level of p-NF-κB and MuRF-1 after immobilization(n=10)A： The level of Atrolnc-1； B： The level of p-NF-κB protein in cytoplasm； C： The level of p-NF-κB protein in nucleus； D： The level of MuRF-1 protein**P<0.01 vs control group

Tab. 4 The levels of p-NF-κB and MuRF-1 protein in each group(%， n=3)

3 討論

制動誘導(dǎo)的肌萎縮常發(fā)生在骨折、長期臥床、缺少運動、神經(jīng)麻痹等條件下[10-12]。Atrogin-1和MuRF-1為肌肉萎縮的標(biāo)志性基因，在許多動物模型(制動、去神經(jīng)、禁食等)中，其表達(dá)均上調(diào)[8, 13, 14]。我們前期發(fā)現(xiàn)，二氯化鈷模擬缺氧可誘導(dǎo)肌萎縮，Atrogin-1的表達(dá)量也升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠后肢制動2周后，腓腸肌的濕重/體重千分比明顯降低，光學(xué)顯微鏡下可見大量肌纖維溶解，測量肌纖維橫截面積減小，Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)均升高，提示制動誘導(dǎo)肌萎縮。

近年來，隨著高通量測序及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的lncRNA，可通過不同的調(diào)控機(jī)制靶向關(guān)鍵因子，參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育的各個環(huán)節(jié)，包括骨骼肌細(xì)胞的增殖、分化、融合和萎縮等[7, 16-20]。最近文獻(xiàn)報道，Atrolnc-1的過度表達(dá)導(dǎo)致慢性腎病小鼠肌纖維萎縮。在本研究中，QRT-PCR檢測到制動后小鼠腓腸肌Atrolnc-1表達(dá)升高，提示Atrolnc-1可能參與調(diào)控制動誘導(dǎo)的肌萎縮。

文獻(xiàn)報道，過表達(dá)Atrolnc-1 48h后，C2C12細(xì)胞核中NF-κB(p65)明顯增加[7]。本研究中，制動誘導(dǎo)小鼠腓腸肌萎縮后，Atrolnc-1表達(dá)升高，胞漿p-NF-κB蛋白表達(dá)降低，但胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高。這些結(jié)果提示在制動誘導(dǎo)肌萎縮的模型中，Atrolnc-1的表達(dá)升高可能激活了NF-κB，并促進(jìn)其入核。據(jù)劉亞南報道，在心肌梗死大鼠模型中，間歇運動降低TNF-a水平，升高HSP70的表達(dá)，抑制NF-κB磷酸化水平的同時MuRF-1表達(dá)降低，從而保護(hù)心肌[21]。最近有文獻(xiàn)報道，將CRISPR/dCas9介導(dǎo)的協(xié)同激活介質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)用于過表達(dá)ABIN-1的C2C12細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ABIN-1過表達(dá)抑制MuRF-1表達(dá)[7]。因此，入核的NF-κB可以促進(jìn)MuRF-1的轉(zhuǎn)錄。MuRF-1屬于泛素蛋白連接酶，與骨骼肌蛋白質(zhì)的分解代謝密切相關(guān)[22]。本研究也檢測到胞核p-NF-κB蛋白表達(dá)升高的同時，MuRF-1表達(dá)也上調(diào)。因此，我們推測制動誘導(dǎo)肌萎縮的機(jī)制可能是Atrolnc-1激活NF-κB，促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核，使MuRF-1的表達(dá)增強(qiáng)，并引起肌肉蛋白的降解，從而導(dǎo)致肌萎縮。

綜上所述，Atrolnc-1可在一定程度上促進(jìn)制動誘導(dǎo)的肌萎縮，可能通過促進(jìn)NF-κB磷酸化并入核，增加MuRF-1的表達(dá)來實現(xiàn)。因此，Atrolnc-1可能是肢體制動或其他疾病引起肌萎縮的潛在治療靶點，為肌萎縮的治療和康復(fù)提供了一個新的方向。