張自新， 陸海洋， 楊治花， 劉長(zhǎng)虎， 詹文華， 折 虹， 趙 仁

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院放療科， 銀川 寧夏 750004)

鼻咽癌是我國(guó)南方常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，放射治療仍然是鼻咽癌首選的治療方式[1]。 雖然放療效果有了很大的提高，但仍然有15%～30%鼻咽癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，尋找引起鼻咽癌轉(zhuǎn)移的基因，對(duì)控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者生存意義重大。有研究表明[3]，抗輻射細(xì)胞的存在與腫瘤放療后失敗關(guān)系密切。復(fù)制蛋白A1(replication protein A1, RPA1)作為同源重組修復(fù)通路中的一員，它在DNA損傷修復(fù)和維持染色體穩(wěn)定性等方面起著重要的作用。N. Givalos等的研究顯示[4],RPA1在轉(zhuǎn)移病灶中高表達(dá)，而在原發(fā)灶中低表達(dá)。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)[5]，RPA1在放射抵抗的鼻咽癌患者的組織中高表達(dá)。因此推測(cè)RPA1可能參與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)是目前常用的生物學(xué)技術(shù)，它通過(guò)將特異性同源雙鏈RNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使目的基因不表達(dá)或低表達(dá)，是研究該基因功能的一種方法。 本研究旨在探討RPA1低表達(dá)對(duì)輻射抗拒的人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞侵襲、遷移及細(xì)胞周期的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室胡國(guó)華教授課題組饋贈(zèng)，是由人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)X線(xiàn)照射60 Gy后仍然存活的細(xì)胞。RPA1-shRNA慢病毒由漢恒生物(上海)科技有限公司構(gòu)建，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連(TaKaRa)公司，RPA1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Chk2、Cdc25C均購(gòu)自Santa Clause公司，p-Chk2、p-cdc25c購(gòu)自CST公司，RPA1和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，CCK8試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技公司，Transwell小室購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將1×105個(gè)CNE-2R細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中，加入10%胎牛血清培養(yǎng)液，置于37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 慢病毒的轉(zhuǎn)染

取1 ml CNE-2R細(xì)胞懸液(含5×104cells/ml)分別接種到六孔板中，分為四組，慢病毒轉(zhuǎn)染組(RPA1-shRNA)、陰性對(duì)照組(NC-shRNA)、加藥對(duì)照組、空白對(duì)照組(CNE-2R)。細(xì)胞貼壁后，慢病毒轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組分別加入含有RPA1-shRNA、NC-shRNA序列的病毒顆粒20 μl(含有8×106個(gè)病毒)。48 h后，在慢病毒轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、加藥對(duì)照組中分別加入濃度為10 μg/ml含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液2 ml，直至加藥對(duì)照組的細(xì)胞完全死亡后，慢病毒轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組繼續(xù)加藥培養(yǎng)5代，分別提取慢病毒轉(zhuǎn)染組(RPA1-shRNA group)、陰性對(duì)照組(NC-shRNA group)及空白對(duì)照組(CNE-2R group)細(xì)胞的總RNA和蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，并選用這三組細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RPA1-shRNA序列為：5’-CCCTAGAACTGGTTGACGAAA-3’; NC-shRNA序列為：5’-GATTGATTGACCTGTCCAT-3’。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)RPA1 mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以Trizol法提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)RNA純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RT-PCR按照Takara說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以GAPDH為內(nèi)參。以2-ΔΔCt計(jì)算RPA1的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

Tab. 1 Primer sequences of RPA1 and GAPDH

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的各組細(xì)胞，以試劑盒提取總蛋白，按照BCA法測(cè)定RPA1蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)模，20%脫脂牛奶封閉2 h，加一抗過(guò)夜(RPA1 1∶2 000)，清洗，加相應(yīng)的二抗孵育2 h，ECL顯像并照相。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的各組細(xì)胞，96孔板內(nèi)每孔種植100 μl細(xì)胞懸液(含2×103個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔， 每組加入10 μl CCK8溶液后，連續(xù)4 d測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.7 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別將200個(gè)細(xì)胞種入6孔板中，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)14 d，固定20 min后染色，室溫下干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于等于50個(gè)細(xì)胞數(shù)的克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將Matrigel膠與無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶8的體積比混合，取30 μl混合液加入Transwell小室的上室中，均勻涂布于基底膜上，過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105cells/ml，在24孔板內(nèi)的Transwell小室中加入100 μl細(xì)胞懸液，在小室外加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，取出小室，沖洗上室，甲醇固定風(fēng)干，染色，擦掉上層遷移細(xì)胞。拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，分別將1 ml細(xì)胞懸液(含5×105cells/ml)種入6孔板中，待細(xì)胞爬滿(mǎn)孔底后用10 μl槍頭垂直劃痕形成無(wú)細(xì)胞區(qū)，分別于0 h、48 h后倒置顯微鏡下觀察、拍照，測(cè)量劃痕寬度，根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算劃痕愈合率[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將1 ml(含1×105cells/ml)各組細(xì)胞分別接種在6 孔培養(yǎng)板中，96 h后收集各組細(xì)胞，離心，每組細(xì)胞加入500 pl細(xì)胞周期檢測(cè)試劑重懸細(xì)胞，室溫下避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RPA1低表達(dá)CNE-2R細(xì)胞株的建立

采用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)RPA1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)RPA1-shRNA組細(xì)胞RPA1 mRNA(0.02645±0.0007)明顯低于CNE-2R組(0.02716±0.0005)和NC-shRNA組(0.08409± 0.0009)，與CNE-2R組和NC-shRNA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a)；與CNE-2R組(0.7436± 0.0006)和NC-shRNA組(0.9335±0.0010)比較，RPA1-shRNA組(0.3374±0.0009)的RPA1蛋白表達(dá)明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖1b)。

Fig. 1 Establishment of CNE-2R cell with silencing RPA1a： RPA1 mRNA was detected by RT-PCR assay； b： Protein of RPA1 was detected by Western blot assay##P<0.01 vs CNE-2R group; **P<0.01 vs NC-shRNA

2.2 RPA1低表達(dá)對(duì)CNE-2R細(xì)胞增殖的影響。

與CNE-2R和NC-shRNA組相比，RPA1-shRNA組細(xì)胞增殖能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2a)。CNE-2R、NC-shRNA、RPA1-shRNA組形成克隆數(shù)分別為(175.33±11.50)、(186.33±74)、(138.33±4.51)，RPA1-shRNA組與其它兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2b、c)。說(shuō)明RPA1低表達(dá)降低了CNE-2R細(xì)胞的增殖能力。

Fig. 2 Effect of knock-down RPA1 on the proliferation of CNE-2R cellA： CCK8 assay； b： Colony formation assay*P<0.05,**P<0.01 vs CNE-2R group； #P<0.05,##P< 0.01 vs NC-shRNA group

2.3 RPA1低表達(dá)對(duì)CNE-2R細(xì)胞遷移的影響

RPA1-shRNA組細(xì)胞劃痕愈合率為[(0.56± 0.28)%]顯著低于CNE-2R組[(0.79±0.02)%]及NC-shRNA組[( 0.74±0.55)%] (P<0.05，圖3)。說(shuō)明RPA1低表達(dá)后CNE-2R細(xì)胞的遷移能力下降。

Fig. 3 Effect of knock-down RPA1 on the migration of CNE-2R cell using Scratch test(×200)

2.4 RPA1低表達(dá)對(duì)CNE-2R細(xì)胞侵襲的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA1-shRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為(90.00±4.00)個(gè)，分別與CNE-2R組[(97.30± 4.50)個(gè)]和NC-shRNA組[(43.00±7.20)個(gè)]比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。說(shuō)明RPA1低表達(dá)后CNE-2R細(xì)胞侵襲能力降低。

Fig. 4 Effect of RPA1 down-regulation on invasion of CNE-2R cell with the use ofTranswell assay(×200)*P<0.05 vs CNE-2R group; #P<0.05 vs NC-shRNA

2.5 RPA1低表達(dá)對(duì)CNE-2R細(xì)胞周期的影響

RPA1-shRNA組G2/M期細(xì)胞的比率明顯高于CNE-2R、NC-shRNA組，RPA1-shRNA組與其它兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。說(shuō)明RPA1低表達(dá)導(dǎo)致CNE-2R細(xì)胞G2/M期阻滯。

Tab. 2 Effect of RPA1 silence on cell cycle distribution of CNE-2R cells(%, n=3)

2.6 RPA1低表達(dá)對(duì)CNE-2R細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：Chk2在RPA1-shRNA組的表達(dá)明顯低于CNE-2R組和NC-shRNA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， 而p-Chk2在RPA1-shRNA組的表達(dá)顯著高于其它兩組(P< 0.05)；細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)調(diào)控蛋白Cdc25c在RPA1-shRNA組的表達(dá)顯著低于CNE-2R組和NC-shRNA組(P<0.05，P<0.01), 而p-cdc25c在RPA1-shRNA組的表達(dá)顯著高于其它兩組(P<0.05, 圖5)。

Fig. 5 Effect of RPA1 silence on the expressions of proteins associated with cell cycle of CNE-2R cells*P<0.05 vs CNE-2R group; #P<0.05,##P<0.01 vs NC-shRNA group

3 討論

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因之一，目前尚缺乏預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子指標(biāo)。同源重組修復(fù)是DNA損傷修復(fù)主要通路之一。復(fù)制蛋白A(RPA1)是DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的主要蛋白之一，它不僅在DNA損傷后修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在減數(shù)分裂中維持全基因組穩(wěn)定性方面也起著重要的作用。人類(lèi)RPA(hsRPA)是由三個(gè)亞型組成的復(fù)合體，即RPA1、RPA2、RPA3。每個(gè)亞基含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，不同的結(jié)構(gòu)域其功能都是不相同的[7]。由于RPA1結(jié)構(gòu)域多，被認(rèn)為是該異源三聚體中最重要的亞基。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，RPA在多個(gè)腫瘤組織中高表達(dá)，而且高表達(dá)的患者局部控制率及生存率都差，食管癌組織中RPA1的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[8]；晚期浸潤(rùn)性膀胱癌患者中，RPA1和RPA2低表達(dá)者愈后差[9]；結(jié)腸癌中，RPA1在轉(zhuǎn)移病灶中高表達(dá)，而在原發(fā)灶中低表達(dá)[4]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)[5]，RPA1在放射敏感的鼻咽癌組織中低表達(dá)，而在放射抗拒的組織中高表達(dá)。因此筆者推測(cè)RPA1可能參與了鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)是由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)降低。近年來(lái)這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)疾病的研究中[10-12]。 本研究采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，將攜帶有RPA1的慢病毒轉(zhuǎn)染輻射抗拒的人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)RPA1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)RPA1-shRNA組細(xì)胞中RPA1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均低于CNE-2R組和NC-shRNA組(P<0.05), 表明RPA1低表達(dá)CNE-2R細(xì)胞模型建立成功。

RPA在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它可以使雙聯(lián)DNA解旋，并且招募聚合酶將三磷酸核苷整合到新合成DNA鏈，保持基因組的完整性。RPA1缺陷將導(dǎo)致DNA自發(fā)性損傷，啟動(dòng)DNA復(fù)制檢查點(diǎn)，抑制細(xì)胞有絲分裂甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。 Wang等[14]的研究表明，RPA1低表達(dá)SK-HEP-1細(xì)胞的增殖能力減退，RPA1高表達(dá)HuH-7細(xì)胞增殖能力增加。Zou等[15]分別在胃癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，RPA1低表達(dá)阻滯了DNA的復(fù)制和細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，RPA1低表達(dá)對(duì)放射抵抗的人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞的增殖能力下降，提示RPA1可能參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

重組同源修復(fù)通路中的多個(gè)蛋白參與了腫瘤的侵襲和遷移。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)BRCA1下調(diào)增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。Chiu等[17]發(fā)現(xiàn)，RAD51上調(diào)使食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力增加。盧其騰等[18]發(fā)現(xiàn)，激活的PARP-1可以促進(jìn)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的侵襲和遷移。RPA1是否參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移目前尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，RPA1被敲低后，CNE-2R細(xì)胞的侵襲及遷移能力降低。表明RPA1可能參與了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移。這還有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(Chk2)在維護(hù)基困組穩(wěn)定性及準(zhǔn)確傳代過(guò)程中起重要作用[19]。既往研究顯示[20],Cdc25C是Chk1和Chk2作用的下游分子, 活化的Chk2可作用于Cdc25C參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。放射治療可以激活Chk2在Thr68位點(diǎn)的磷酸化，Chk2參與了DNA損傷信號(hào)通路[21]。該研究發(fā)現(xiàn)，RPA1低表達(dá)使CNE-2R細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在RPA1-shRNA組中Chk2、Cdc25c低于對(duì)照組，而p-Chk2、p-cdc25c高于對(duì)照組。這可能為RPA1敲減后阻礙了CNE-2R細(xì)胞染色體的復(fù)制，導(dǎo)致了染色體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)最終發(fā)生了改變，從而誘導(dǎo)ATM自身磷酸化后被激活，活化的ATM再進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(Chk2)，磷酸化的Chk2再磷酸化Cdc25c磷酸酯酶，最終導(dǎo)致了細(xì)胞周期停止在G2/M期[19]。

綜上所述，本研究表明RPA1低表達(dá)抑制了輻射抵抗人鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞增殖、遷移，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。這可能為鼻咽癌的預(yù)后判斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。