丁茂鵬， 韋凌霞， 王志旺， 程小麗， 龐亞蓉

(甘肅中醫(yī)藥大學, 蘭州 730000)

在中醫(yī)理論中，肝有“體陰而用陽”的生理特點與“陽常有余陰常不足”的病理特點，所以“體陰而陰不足”當屬肝病的基本病機[1, 2]。在以上中醫(yī)藥理論的指導下擬定的鱉甲育肝顆粒具有軟肝散積、育陰調肝之效，臨床上對肝纖維化有明顯療效。慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中，肝細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的合成與降解失衡是肝纖維化發(fā)生的主要機制[3]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是促肝纖維化的關鍵因子，可通過Smads通路激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)而分泌細胞外基質，促進肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[4]。本實驗在復制肝纖維化大鼠模型的基礎上，研究鱉甲育肝顆粒對肝纖維化的治療作用及對TGF-β1/Smads信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甘肅中醫(yī)藥大學藥理學教研室提供的鱉甲育肝顆粒(Biejia Yugan Granule, BYG)，由鱉甲、山茱萸、柴胡、黃芩等中藥制成，批號：20181206；西雙版納版納藥業(yè)責任有限公司生產的秋水仙堿片(Colchicine)，國藥準字：H53021369，批號：20190203。南京建成生物工程研究所生產的天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)；北京北方生物技術研究所生產板層素(laminin, LN)、Ⅲ型前膠原(Ⅲprocollagen, PCⅢ)、Ⅳ型膠原(type IV collagen, C-Ⅳ)以及透明質酸(hyaluronic acid, HA)ELISA試劑盒；武漢博士德生物工程有限公司生產TGF-β1抗體免疫組化試劑盒。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

BI-2000型醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司產品；CFX型Peal-Time熒光定量PCR儀，美國伯樂公司產品；S1000TM逆轉錄儀，美國BIO-RAD公司產品；Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司產品；日本Olympus生產的CH-212型光學顯微鏡。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重200～230 g，中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產，SCXK(甘)2015-0001為實驗動物質量合格證。飼養(yǎng)在甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，SYXK(甘)2015-0005為實驗動物設施使用許可證。

1.4 造模、給藥

將大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、秋水仙堿組(1.0×10-4g/kg)、鱉甲育肝顆粒各劑量組(1.85、3.70、7.40 g/kg，n=8)。結合預實驗結果與文獻[5]，采用灌胃乙醇并皮下注射四氯化碳的方法來復制大鼠肝纖維化模型，在每天灌胃5%乙醇15 ml/kg的基礎上，每周皮下注射40%四氯化碳橄欖油2次，第一次5.0 ml/kg，以后各次3.0 ml/kg，連續(xù)造模6周。從造模開始灌胃給藥，每日一次，連續(xù)給藥6周。

1.5 取材、指標測定

實驗第43日，大鼠稱重、麻醉，股靜脈取血后處死，手術摘取肝臟，稱重，在固定位置取肝組織3份，第1份肝組織精密稱重，干燥至恒重后再稱重，計算含水量；第2份肝組織經多聚甲醛固定，切片經免疫組化染色，觀測肝組織TGF-β1表達特點并進行半定量分析；第3份肝組織采用PCR法測定Smad3、Smad7基因表達水平。肝組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.6 PCR法測定肝組織Smad3、Smad7基因表達

取大鼠肝組織加RNAico Plus于冰上勻漿，經提取、沉淀、洗滌等步驟得總RNA。紫外分光光度法測定其濃度后，在反轉錄反應體系中合成第一鏈cDNA，作為實時熒光定量RT-PCR分析的模板，檢測目標基因Smad3、Smad7與GAPDH表達的熒光強度，以模型對照組為對照計算△△Ct，采用2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量，比較各組目標基因表達的差異性。引物為生工生物工程(上海)股份有限公司生產，Smad3(153 bp)：上游5'-CGTCCGATCCTCCCTTCAC-3'，下游5'-CCAAGCTCTTGCCCGCCTTC-3'；Smad7(276 bp)：上游5'-AACTGCAGACTGTGCAGACG-3'，下游5'-TTGGGAATCTGAAAGCCCCC-3'；GAPDH(217)：上游5'-GGCAAGTTCAACCGGCACAG-3'，下游5'-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 鱉甲育肝顆粒對大鼠肝臟組織形態(tài)學的影響

肝組織TGF-β1免疫組化染色后，高倍鏡下空白對照組大鼠肝小葉結構完整、肝細胞排列整齊，期間偶有灰色TGF-β1表達，著色較淺；模型對照組大鼠肝小葉結構不完整，期間夾雜大量膠原纖維沉積，TGF-β1廣泛表達于匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇壁等細胞核周圍的胞漿內，著色較深。在鱉甲育肝顆粒的干預下，大鼠肝小葉及肝細胞上述病理變化出現(xiàn)明顯改善，TGF-β1的表達出現(xiàn)不同程度減輕(圖1)。

Fig. 1 Effects of BYG on TGF-β1expression in HF rats (×40)A: Control group; B: Model group; C: Colchicine group; D: BYG-L group; E: BYG-M group; F: BYG-H group

2.2 鱉甲育肝顆粒對肝纖維化大鼠肝功能的影響

表1結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST及ALP的活性顯著升高(P< 0.01)。與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預組，ALT、AST及ALP的活性均顯著下降(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量組比較，高劑量組大鼠血清中ALP活性顯著下降(P<0.01)。

Tab. 1 Effects of BYG on liver functions in HF rats (U/L, n=8)

2.3 鱉甲育肝顆粒對肝纖維化大鼠肝指數及其含水量的影響

表2結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織含水量與肝指數顯著升高(P<0.01)；秋水仙堿和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預組大鼠肝組織含水量與肝指數均顯著下降(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of BYG on liver index and water content in HF rats (%, n=8)

2.4 鱉甲育肝顆粒對肝纖維化大鼠血清肝纖維化相關指標的影響

表3結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN質量濃度均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預組大鼠血清中HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN質量濃度均顯著下降(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of BYG on liver fibrosis related indexes in HF rats (μg/L, n=8)

2.5 鱉甲育肝顆粒對肝纖維化大鼠肝組織Smad3、Smad7基因表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中Smad3與Smad7基因表達顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿組和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預組Smad3 mRNA表達明顯下降，而Smad7 mRNA表達持續(xù)升高(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量比較，低、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表4)。

Tab. 4 Effects of BYG on expressions of Smad3 mRNA and Smad7 mRNA in HF rats n=8)

2.6 鱉甲育肝顆粒對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達的影響

半定量分析顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中TGF-β1表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿和不同劑量大鼠肝組織中TGF-β1表達的平均光密度值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，秋水仙堿和不同劑量鱉甲育肝顆粒干預組TGF-β1表達水平顯著下降(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒中劑量比較，低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表5)。

Tab. 5 Effects of BYG on TGF-β1 expression in HF rats n=8)

3 討論

肝纖維化是肝臟對多種慢性損傷的修復過程中，肝組織細胞外基質(ECM)合成增加或降解減少、纖維組織大量沉積的病理過程。肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經階段，肝臟病理學專家Hans Popper指出：“誰能阻止或延緩肝纖維的發(fā)生，誰就將治愈大多數慢性肝病”，因此緩解肝纖維化進程在整個肝病的治療中有重要意義[6]。鱉甲育肝顆粒是在肝“體陰而陰不足”等中醫(yī)理論的指導下配制的，由鱉甲、山茱萸、柴胡、黃芩等中藥制成，具有育陰調肝、軟肝散積的功效，臨床上主要用于慢性肝炎之肝纖維化以及肝硬化的治療[7]。四氯化碳、乙醇具有肝毒性，是目前常用的復制肝纖維化動物模型的化學藥物，本次研究采用四氯化碳、乙醇來復制肝纖維化動物模型[8]。ALT、AST及ALP是評價肝功能的重要指標，ALT主要存在于肝細胞漿中，在肝內酶活性明顯高于血清，因此，少量肝細胞壞死即可導致血清ALT水平明顯增高；AST主要分布在肝細胞線粒體內，當肝細胞壞死，AST可從線粒體中釋放出來，進而導致血清AST明顯升高[9]；ALP升高是由于肝細胞受損、微膽管梗阻所致，故這些指標的含量可反映肝細胞的受損情況[10]。血清中HA，LN，C-Ⅳ和PCⅢ與肝纖維化程度密切相關，PCⅢ可反映肝Ⅲ型膠原的合成，并且血清含量與肝纖維化程度一致；Ⅳ-C是構成基底膜的主要成份，是反映基底膜膠原更新的靈敏指標；LN是基底膜總特有的非膠原性結構蛋白，與肝纖維化活動呈正相關；HA由間質細胞合成可較準確反映肝內生成纖維量及肝細胞受損情況，也是衡量肝纖維化的敏感指標[11, 12]。此外，研究表明慢性肝炎及肝纖維過程中，炎癥反應可引起肝組織充血、水腫，而肝組織含水量也能間接反映肝組織炎癥反應的程度[13]。本研究結果顯示，在乙醇與四氯化碳的影響下，大鼠血清肝功能指標(ALT、AST、ALP)、肝纖維化指標(HA，LN，C-Ⅳ、PCⅢ)及肝組織含水量均顯著升高，表明肝纖維化造模成功。在給予鱉甲育肝顆粒后，肝組織含水量及肝指數、血清ALT、ALP及AST含量均顯著降低，HA、LN、C-Ⅳ及PCⅢ含量降低提示鱉甲育肝顆粒對肝纖維化有明顯的降酶保肝作用。

TGF-β1是公認的最強致肝纖維化的細胞因子之一，TGF-β1/Smads通路是目前發(fā)現(xiàn)的最經典的參與肝纖維化的信號通路，主要由細胞膜外TGF-β1、膜上TβR受體與膜內Smads組成[14]。當肝臟受到外界刺激而發(fā)生損傷時，TGF-β1與細胞膜表面的TβRII結合，激活TβRI的絲氨酸/蘇氨酸激酶，磷酸化后的TβRI激活Smad3并與Smad4形成轉錄復合物進入核內，調節(jié)靶基因的轉錄及蛋白質的合成，促進HSC轉化并加速ECM的合成[15, 16]。Smad7是TβRI型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，Smad7與TβRI受體結合后可干擾Smad3的磷酸化，從而在TGF-β1/Smads信號轉導中構成負反饋調節(jié)環(huán)路，抑制纖維化的發(fā)生與發(fā)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鱉甲育肝顆粒的干預下，肝組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平下調，而Smad7 mRNA的表達上調，提示抑制TGF-β1/Smads信號通路是鱉甲育肝顆?？垢卫w維化的作用機制之一。