王曉琳，吳琴燕，彭燕瓊，鄔 劼，黃潔雪，毛妮妮，吉沐祥

（1江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212400；2江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212499）

0 引言

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉[Plasmopara viticola(Berk.et Curtis)Berl.et de Toni]引起的一種世界性病害，也是中國(guó)葡萄產(chǎn)區(qū)主要病害之一[1-2]。葡萄霜霉病通常發(fā)生在溫和潮濕的葡萄種植區(qū)域，是氣候主導(dǎo)的流行性病害，一般危害時(shí)造成葡萄損失達(dá)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%～80%，甚至導(dǎo)致葡萄園顆粒無(wú)收，造成毀滅性的損失[3]。目前生產(chǎn)上防治葡萄霜霉病還是以化學(xué)防治為主，如今的大多數(shù)化學(xué)殺菌劑都是單一作用位點(diǎn)，以一種方式作用于植物病原體，重復(fù)利用這些農(nóng)藥勢(shì)必會(huì)帶來(lái)抗性。在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)上登記防治葡萄霜霉病的化學(xué)農(nóng)藥主要有：吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、波爾多液、百菌清、克菌丹、啶氧菌酯、代森聯(lián)、氰霜唑、雙炔酰菌胺和嘧菌酯等，而登記的生物農(nóng)藥只有植物源殺菌劑丁子香酚和苦參堿，微生物農(nóng)藥哈茨木霉菌。寡糖又被稱為低聚糖，通常是由3～10個(gè)單糖單元通過(guò)糖苷鍵連接構(gòu)成的。按照構(gòu)成寡糖的單糖種類劃分，寡糖可分為葡萄糖寡糖、木糖寡糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖等。按照功能性劃分，寡糖可分為普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖容易被腸道消化吸收，一般作為甜味劑應(yīng)用，如蔗糖和乳糖。功能性寡糖通常不容易被機(jī)體消化和吸收，但是具有一定的活性[4]。

目前發(fā)現(xiàn)殼寡糖、β-葡寡糖和褐藻膠寡糖等能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)[5-7]。β-1,3-葡寡糖可以作為一種激發(fā)子，誘導(dǎo)植物自身免疫系統(tǒng)分泌抗生素，對(duì)致病菌產(chǎn)生抗性，從而抵抗病原體的侵入，β-1,3-葡寡糖能夠抑制多種病原性真菌的生長(zhǎng)，如煙草軟腐病[8]。氨基寡糖素能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，寡糖植物免疫誘抗劑作用對(duì)象廣譜，目前在西瓜[9]、蘋果[10]、馬鈴薯[11]和番茄[12]等植物中均有報(bào)道。史茹研究發(fā)現(xiàn)5%氨基寡糖素AS用量1500 g/hm2時(shí)，對(duì)西瓜枯萎病防效為88.2%[9]。0.5%氨基寡糖素AS對(duì)蘋果離體枝條有較強(qiáng)的保護(hù)作用，對(duì)腐爛病的防治效果為89.0%[10]。50倍3%氨基寡糖素噴種+500倍3%香菇多糖噴施葉片可誘導(dǎo)馬鈴薯對(duì)瘡痂病產(chǎn)生抗性，防治效果為68.9%[11]。張胡煥[12]發(fā)現(xiàn)5%氨基寡糖素AS對(duì)番茄葉霉病有一定的防效，與48%苯甲·嘧菌酯SC混用能抗病增效，減少殺菌劑的使用量。氨基寡糖素除具有公認(rèn)的誘導(dǎo)抗病能力外，還可以增強(qiáng)植物的抗逆能力，如提高植物抗寒性[13]、抗旱性[14]和抗?jié)承訹15]。陸紅霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)100 ppm氨基寡糖素浸種番茄種子可提高番茄苗的抗寒性。此外，氨基寡糖素還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善作物品質(zhì)和提高次生代謝物產(chǎn)量等功能[16]。本試驗(yàn)選用2種誘抗劑β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素對(duì)葡萄進(jìn)行霜霉病試驗(yàn)，明確2種誘抗劑對(duì)葡萄霜霉病抗性生理指標(biāo)的影響及對(duì)霜霉病的防效，旨在為葡萄霜霉病的防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葡萄：‘夏黑’，樹齡6年。

供試藥劑：β-1,3-葡寡糖由南京理工大學(xué)提供；2%氨基寡糖素AS由山東國(guó)潤(rùn)生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；50%氟醚菌酰胺WDG由山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

儀器：Multiskan FC型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Haier醫(yī)用低溫保存箱DW-86L626：青島海爾特種電器有限公司；高通量組織研磨儀TL-48P：上海萬(wàn)柏生物科技有限公司；移液槍：德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2017年在句容市華陽(yáng)街道弘景路1號(hào)鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄園完成。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)處理。處理1為β-1,3-葡寡糖10倍；處理2為β-1,3-葡寡糖100倍；處理3為2%氨基寡糖素AS 750倍；處理4為50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍；處理5為清水。各處理于6月17日開始第一次噴霧，噴藥采用霧星3JWB-16A背負(fù)式電動(dòng)靜電噴霧器（工作壓力為0.15～0.4 MPa；流量12 L/h；霧滴中徑≤120 μm）噴霧，對(duì)照區(qū)噴施清水。7天一次，共3次，3次藥后7天調(diào)查新梢葉片數(shù)和發(fā)病葉片數(shù)，并按分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葡萄葉片幾丁質(zhì)酶(CHI)活性測(cè)定 使用幾丁質(zhì)ELISA試劑盒（購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司）對(duì)CHI的活性進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)具體操作如下：3次藥后3天和7天分別取新梢發(fā)生的完全展開新葉，每處理10片，取保鮮葉片1 g，加入0.5g pvpp和7 mL pH 6.0的磷酸緩沖溶液，碾磨后，靜置提取30 min，離心取上清液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CHI活性濃度。CHI活定義為在37℃下，1 mL酶液1 min生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖時(shí)所需酶量為1 U。

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定 應(yīng)用ELISA試劑盒雙抗體夾心法測(cè)定各處理葡萄葉片PAL水平。PAL酶液的制備：分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的硼酸緩沖液（pH 8.8，含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA），研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液待測(cè)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(OD450nm)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中PAL活性。以每分鐘光密度變化0.01所需酶量為1 U。

1.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 SOD酶液的制備：分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.0)，研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液即為待測(cè)酶液。SOD以25℃時(shí)抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)所需的SOD量為1 U。

1.3.4 過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定 POD酶液的制備：分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.0)，研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液即為待測(cè)酶液。POD酶活定義為每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片PAL活性的影響

由圖1可知：3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高PAL的活性；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高PAL的活性，β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過(guò)低使得它在處理7天后未能顯著提高PAL的活性。

圖1 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片PAL活性的影響

2.2 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片CHI活性的影響

由圖2可知：3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高CHI的活性，其中β-1,3-葡寡糖10倍對(duì)CHI活性的提高程度高于2%氨基寡糖素AS 750倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過(guò)低使得它在處理后未能顯著提高CHI的活性。

圖2 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片CHI活性的影響

2.3 生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片POD活性的影響

由圖3可知：3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對(duì)POD活性的提高程度高于β-1,3-葡寡糖10倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過(guò)低使得它在處理后未能顯著提高POD的活性。

圖3 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片POD活性的影響

2.4 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片SOD活性的影響

由圖4可知，3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖10倍、β-1,3-葡寡糖100倍和2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對(duì)照差異不顯著；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和β-1,3-葡寡糖100倍相比對(duì)照能顯著提高葡萄葉片SOD的活性，2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對(duì)照差異不顯著。

圖4 噴施生物誘抗劑對(duì)葡萄葉片SOD活性的影響

2.5 2種生物誘抗產(chǎn)品對(duì)葡萄霜霉病的抗病試驗(yàn)

田間試驗(yàn)表明，β-1,3-葡寡糖10倍，抗病效果最高，病葉防效為62.59%，病指防效為65.44%，與化學(xué)藥劑50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍病葉防效(45.54%)和病指防效(64.11%)無(wú)顯著差異。2%氨基寡糖素AS 750倍也有一定的抗病效果，病葉防效為25.83%，病指防效為46.41%，但明顯低于β-1,3-葡寡糖10倍和化學(xué)藥劑50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍的抗病作用。而β-1,3-葡寡糖100倍，與清水對(duì)照無(wú)顯著差異（表1）。

表1 β-1,3-葡寡糖等對(duì)葡萄霜霉病抗病效果

3 結(jié)論與討論

有研究結(jié)果表明，植物誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生常常是通過(guò)酶催化調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的。植物受到病原菌侵染或被誘導(dǎo)處理后，與抗病反應(yīng)密切相關(guān)的防御酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一[17]。本研究以β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素為誘導(dǎo)劑，研究其對(duì)葡萄霜霉病的誘導(dǎo)抗性，并通過(guò)測(cè)定β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素誘導(dǎo)后，葡萄葉片防御酶系活性的變化，揭示β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素誘導(dǎo)葡萄產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性的可能機(jī)制。研究結(jié)果表明，3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高PAL的活性；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高PAL的活性。商文靜[17]研究結(jié)果表明，殼寡糖誘導(dǎo)后煙葉體內(nèi)和抗病性相關(guān)的各種防御酶活性均有不同程度的變化，PAL活性在接種后有大幅度升高，這與本研究結(jié)果類似。PAL通過(guò)催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸這一不可逆過(guò)程，從而進(jìn)入苯丙烷代謝途徑，進(jìn)一步介導(dǎo)類黃酮、木質(zhì)素、花青素、植物抗毒素和植物激素等的生物合成，進(jìn)而合成多種具有抗菌作用的產(chǎn)物，是植物次生代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，酶活性的高低與植物的抗病性密切相關(guān)。噴施生物誘抗劑后，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對(duì)POD活性的提高程度高于β-1,3-葡寡糖10倍。POD參與木質(zhì)素、木栓質(zhì)和醌類物質(zhì)的合成，促進(jìn)侵染點(diǎn)愈合并抑制病原菌果膠分解酶、纖維素分解酶等酶的活性，提高植物抗性。噴施生物誘抗劑后，3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高CHI的活性，植物的CHI是一種病程相關(guān)蛋白，直接催化真菌細(xì)胞壁的主要成分β-1,4-聯(lián)結(jié)的N-乙酰-D-葡萄胺水解，具有直接殺傷或抵抗病原的活性與作用，而且受到水楊酸等其他抗病相關(guān)分子的調(diào)控，在植物防御過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。噴施生物誘抗劑后，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對(duì)照差異不顯著；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和β-1,3-葡寡糖100倍相比對(duì)照能顯著提高葡萄葉片SOD的活性，2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對(duì)照差異不顯著。SOD是活性氧清除反應(yīng)過(guò)程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，能將O2-快速歧化為H2O2和分子氧，是抗逆性相關(guān)的酶。

檀志全等[18]研究發(fā)現(xiàn)5%氨基寡糖素AS對(duì)葡萄霜霉病的預(yù)防效果為78.29%，對(duì)葡萄炭疽病的預(yù)防效果為60.00%。李育林[19]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3次噴施3%氨基寡糖素AS 250倍液對(duì)葡萄霜霉病的防效達(dá)74.73%，與化學(xué)藥劑40%烯酰嗎啉2000倍液無(wú)顯著性差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)2%氨基寡糖素AS 750倍對(duì)葡萄霜霉病的病指防效為46.41%。孫輝[20]研究發(fā)現(xiàn)寡聚糖具有體外抑菌活性，能誘導(dǎo)植物的抗病性，表現(xiàn)為降低發(fā)病程度，組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)特征明顯變化，但抗病性誘導(dǎo)需要較高的濃度。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡寡糖10倍對(duì)葡萄霜霉病的病指防效達(dá)60%以上，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對(duì)照能顯著提高CHI，PAL和POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對(duì)PAL活性的提高程度顯著高于β-1,3-葡寡糖10倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過(guò)低使得它僅在處理3天后能顯著提高PAL的活性，其他時(shí)間這3種酶活均與對(duì)照無(wú)顯著差異，且田間防效也極差。β-1,3-葡寡糖處理7天后能顯著提高SOD酶活，提高程度與濃度正相關(guān)，能夠顯著提高葡萄霜霉病抗性的β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍處理均能顯著提高葡萄CHI、PAL和POD酶活，表明足夠濃度的誘抗劑能夠通過(guò)誘導(dǎo)植物體內(nèi)防御酶和抗病相關(guān)蛋白活性升高提高植物抗病性。本研究中，防御酶和抗病相關(guān)蛋白活性變化是β-1,3-葡寡糖誘導(dǎo)葡萄抗葡萄霜霉病侵染的原因之一。