于 鵬， 尹天翔， 羅彩云， 曾 萍

(宜昌市中心人民醫(yī)院麻醉科， 湖北 宜昌 443008)

骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤，術后結合化療是骨肉瘤的重要治療方式，其顯著改善了患者生存率和預后，但化療的毒副反應和多藥耐藥的產生是局部復發(fā)、遠處轉移及治療失敗的重要原因[1, 2]。因此研究骨肉瘤化療的耐藥機制，逆轉其耐藥對臨床治療有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分麻醉藥通過影響腫瘤細胞的凋亡、增殖、轉移而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。對腫瘤術后化療患者進行麻醉處理對治療有一定的輔助作用[4]。鹽酸羅哌卡因是一種新型長效酰胺類局麻藥，其可抑制胃癌細胞AGS和HG-27的增殖[5]。羅哌卡因能抑制結腸癌細胞增殖和結腸癌皮下瘤的生長[6]。羅哌卡因能夠以劑量和時間依賴性的方式抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡[7]。Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員，骨肉瘤組織Livin高表達與腫瘤浸潤、轉移密切相關，提示預后不良，可作為骨肉瘤的潛在治療靶點及判斷預后的分子指標[8]。RNA干擾下調Livin基因表達可有效促進耐藥MG-63骨肉瘤細胞的凋亡，從而增加其對化療藥物的敏感性[9]。然而鹽酸羅哌卡因對骨肉瘤及其是否通過調控Livin對骨肉瘤的影響鮮有研究報道。本實驗通過建立骨肉瘤多柔比星耐藥細胞，研究鹽酸羅哌卡因對其增殖、侵襲、凋亡及化療敏感性的影響及其是否與Livin有關，以期為臨床應用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

骨肉瘤細胞U2OS購自上?？吕咨锟萍加邢薰?；鹽酸羅哌卡因(國藥準字H20173027)購自河北一品制藥股份有限公司；多柔比星(國藥準字H33021980)購自海正輝瑞制藥有限公司；胎牛血清(貨號：SH30071.03，美國Hyclone公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號31800022：，美國Gibco公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(貨號：11668019，美國Invitrogen公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(貨號：JKSJ-1812，德國IBL公司)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(貨號：40200080-4，美國Bio-world)；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(貨號：218073，德國Qiagen)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(貨號：120148，北京凱基生物技術股份有限公司)。P21(貨號：251259，美國Abbiotec)、Cleaved Caspase-3(貨號：abx012079，英國Abbexa)、E-cadherin(貨號：200134，美國Abbiotec)、MMP-2(貨號：250752，美國Abbiotec)、Livin(貨號：251257，美國Abbiotec)、GAPDH(貨號：251330，美國Abbiotec)；山羊抗兔-HRP(貨號：656120，美國Invitrogen公司)。

1.2 骨肉瘤多柔比星耐藥細胞株的建立

骨肉瘤細胞U2OS置于含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，然后于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，多柔比星是蒽環(huán)類抗生素的原型化合物，臨床常用的腫瘤化療藥物，也是骨肉瘤常用化療藥物，本實驗以多柔比星(Doxorubicin，DOX)為誘導劑，采用逐步增加藥物劑量誘導耐藥細胞，最開始用加入0.1 μg/ml的多柔比星培養(yǎng)基，48 h后篩選存活細胞繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3代后取穩(wěn)定存活細胞繼續(xù)用加入高濃度的多柔比星培養(yǎng)，添加的多柔比星濃度依次為0.1、1、10、100、200 μg/ml，每種藥物48 h選擇存活細胞繼續(xù)培養(yǎng)，均培養(yǎng)3代穩(wěn)定藥性，最后在濃度為200 μg/ml的多柔比星下仍能生長的細胞即為耐藥細胞，命名為U2OS/DOX。

1.3 細胞處理與分組

取對數(shù)生長期U2OS/DOX細胞，用濃度分別為0、20、50、100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理U2OS/DOX細胞，作為不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組；分別將0.5 μg的pcDNA3.1質粒載體和pcDNA3.1-Livin質粒載體用50 μl的培養(yǎng)液稀釋，然后將其和50 μl用培養(yǎng)液稀釋的LipofectamineTM2000轉染試劑混合，室溫靜置20 min，將上述混合液加至500 μl含有U2OS/DOX細胞(5×105cells/ml)的培養(yǎng)板中，轉染6 h后再用濃度為100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理24 h，記為鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組。

1.4 MTT檢測細胞增殖抑制率及細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)

用濃度為0.1、1、10、100、200 μg/ml多柔比星處理U2OS和U2OS/DOX細胞，培養(yǎng)48 h后，分別加入MTT試劑反應，然后檢測波長為490 nm的光密度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。實驗重復3次。繪制抑制率曲線，計算藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。計算耐藥指數(shù)(RI)=IC50(U2OS/DOX)/IC50(U2OS)[10]。

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組細胞培養(yǎng)48 h后也按上述方法檢測細胞增殖抑制率。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)法檢測P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2、Livin、t-Livin蛋白表達

收集各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞蛋白，用BCA方法進行定量，然后取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠(10%)電泳，轉膜后加入一抗、二抗孵育，然后顯影成像，用Quantity One凝膠軟件檢測各條帶灰度值，蛋白表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)

各組細胞制成1×104cells/ml的懸液，以每孔100個細胞接種于六孔板中，每組設3個復孔，培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，甲醇固定后吉姆薩染色，在顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集細胞，用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.8 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

取200 μl細胞懸液接種在Transwell小室上室中，下室加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色后在顯微鏡下觀察，并隨機選擇5個視野計數(shù)，取其平均數(shù)即是細胞遷移數(shù)；用基質膠將Transwell小室包被后再按照細胞遷移實驗步驟操作即是細胞侵襲數(shù)。

1.9 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Livin mRNA表達水平

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組細胞培養(yǎng)48 h后提取總RNA，取2 μl RNA反轉錄成cDNA，Livin以β-actin為內參進行定量PCR擴增，循環(huán)條件為95℃變性15 s，60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。相對表達量采用2-△△Ct法計算。Livin mRNA相對表達量=2-△△Ct，△△Ct=(CtLivin-Ct內參)-(Ct對照-Ct內參)。Livin上游引物序列：5'-GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA-3'，下游引物序列：5'-GGCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3'；β-actin上游引物序列：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，下游引物序列：5'-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞U2OS及骨肉瘤耐藥細胞U2OS/DOX對化療藥物多柔比星IC50和耐藥指數(shù)

多柔比星濃度大于1 μg/ml時，骨肉瘤細胞U2OS增殖抑制率顯著升高，且具有劑量依賴性(P<0.05)；多柔比星濃度大于10 μg/ml時，骨肉瘤細胞骨肉瘤耐藥細胞U2OS/DOX增殖抑制率顯著升高，且具有劑量依賴性(P<0.05，圖1)。U2OS和U2OS/DOX細胞的半數(shù)抑制濃度分別是1.49± 0.03，119.96±0.11；耐藥指數(shù)為80.51±5.65；U2OS/DOX細胞較U2OS細胞耐藥，說明U2OS/DOX為骨肉瘤耐藥細胞。

Fig. 1 Effects of doxorubicin on the inhibition rate of U2OS and U2OS / DOX cells

2.2 鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX增殖、凋亡的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細胞中，P21、Cleaved Caspase-3表達水平顯著升高，細胞增殖抑制率顯著升高，克隆形成數(shù)顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖2，表1)。

Fig. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS/DOX clone formation, apoptosis and expression of P21 and Cleaved Caspase-3 proteins

2.3 鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX遷移、侵襲的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細胞中，E-cadherin表達水平顯著升高，MMP-2表達水平顯著降低，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖3，表2)。

Fig. 3 Effects ofropivacaine hydrochloride on the expression of E-cadherin and MMP-2 proteins and number of migration and invasion cells in U2OS / DOX cells treated with doxorubicin

Tab. 1 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX proliferation and apoptosis

Tab. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on the migration and invasion of U2OS / DOX in cells treated with doxorubicin

2.4 鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX中Livin表達的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細胞中Livin蛋白表達水平顯著降低，t-Livin表達水平顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖4，表3)。

Tab. 3 Effect ofropivacaine hydrochloride on the mRNA expression of Livin in U2OS / DOX cells treated by doxorubicin

Fig. 4 Livin protein expression

2.5 過表達Livin能逆轉鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX增殖的抑制作用及凋亡的促進作用

與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比，鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細胞中P21、Cleaved Caspase-3表達水平顯著降低，細胞抑制率顯著降低，細胞克隆形成數(shù)顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05，圖5，表4)。

Fig. 5 Overexpression ofLivin can reverse the effects of ropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX clone formation, apoptosis and the effects of P21 and Cleaved Caspase-3 protein expression

2.6 過表達Livin能逆轉鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX遷移、侵襲的抑制作用

與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比，鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細胞中Livin表達水平顯著升高，t-Livin表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著降低，MMP-2表達水平顯著升高，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05，圖6，表5)。

Fig. 6 Expressions of related proteins and detection of migration and invasion cells

Tab. 4 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effect of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX proliferation and promote apoptosis

Tab. 5 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effects of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX migration and invasion

3 討論

骨肉瘤是常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，隨著化療等治療方式的進步，明顯改善了骨肉瘤患者預后，但化療耐藥是如今骨肉瘤化療治療的一大問題，逆轉其化療耐藥性是提高其療效的關鍵[11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥物可影響腫瘤患者免疫功能及腫瘤患者術后轉移和復發(fā)[12]。據(jù)報道，羅哌卡因可抑制人甲狀腺癌細胞增殖，誘導其凋亡，且呈劑量依賴性[13]。高濃度的羅哌卡因對結腸癌和胰腺癌細胞具有體外抗增殖作用[14]。羅哌卡因可顯著降低結腸癌細胞SW480和SW620的活力[15]。他莫昔芬通過增加人骨肉瘤細胞MG-63對化療藥物多柔比星的敏感性而抑制細胞增殖[16]。本實驗建立骨肉瘤耐藥細胞U2OS/DOX后用不同濃度的鹽酸羅哌卡因處理，細胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)及遷移、侵襲數(shù)顯著減少； P21、Cleaved Caspase-3、E-cadherin的表達水平顯著升高， MMP-2表達水平顯著下降，呈濃度依賴性。P21是細胞周期相關蛋白，其高表達可阻滯細胞周期，抑制細胞增殖；而Cleaved Caspase-3是凋亡相關蛋白，其高表達表明細胞凋亡增多；E-cadherin是細胞間質相關蛋白，MMP-2是基質金屬蛋白酶，其均影響細胞遷移侵襲；因此，本實驗結果說明，鹽酸羅哌卡因可劑量依賴性的抑制U2OS/DOX細胞增殖、遷移、侵襲，并促進細胞凋亡，其可能與調控相關蛋白表達有關；即鹽酸羅哌卡因增加了骨肉瘤細胞對多柔比星的敏感性；與在其他腫瘤中相似，也具有抗癌作用。

Livin在骨肉瘤中高表達，與骨肉瘤的Enncking分期與腫瘤大小顯著相關，是骨肉瘤患者的獨立預后因素[17]。敲除Livin可以顯著降低U2OS細胞的細胞增殖，集落形成及侵襲和遷移能力，并增強人骨肉瘤細胞對順鉑的化學敏感性[18]。沉默Livin通過調節(jié)細胞凋亡和自噬，提高了結腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[19]。敲低Livin誘導頭頸部鱗狀細胞癌細胞凋亡，并增強了順鉑，5-氟尿嘧啶和多西他賽化療誘導的細胞凋亡[20]。以上研究表明，Livin參與調控包括骨肉瘤在內的多種腫瘤的進展及藥物敏感性。Livin是細胞凋亡抑制劑蛋白家族的成員，該家族抑制多種刺激觸發(fā)的細胞凋亡；半胱天冬酶可以裂解Livin產生截短的蛋白t-Livin；當Livin水平降低時，t-Livin水平便相對升高[21]。本實驗結果顯示，鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細胞中Livin表達水平顯著降低，t-Livin表達水平升高。提示鹽酸羅哌卡因抗體可調控U2OS/DOX細胞中Livin的表達。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，過表達Livin逆了轉鹽酸羅哌卡因對細胞U2OS/DOX惡性生物學行為的影響。提示，鹽酸羅哌卡因可能通過調控Livin表達影響U2OS/DOX細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，鹽酸羅哌卡因能明顯抑制對多柔比星具有耐藥性的骨肉瘤細胞的增殖，遷移和侵襲，明顯促進骨瘤細胞凋亡，其機制可能與Livin有關。