張巖巖， 劉 華， 宋 揚(yáng)， 郭海艷

(唐山市工人醫(yī)院耳鼻喉科， 河北 唐山 063000)

喉癌發(fā)生率約占頭頸部腫瘤的20%，也是頭頸部繼鼻咽癌之后第二大類惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著患者生命安全，降低生活質(zhì)量[1，2]。喉癌起病隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，手術(shù)治療效果不佳，但化療藥物治療腫瘤的同時(shí)，人體正常器官亦受到極大損害，因此，研發(fā)或探索新型抗腫瘤藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)。中藥作為我國特有的衛(wèi)生資源，具有巨大的原創(chuàng)優(yōu)勢及發(fā)掘潛力，白花蛇舌草出自《廣西中藥志》，具有“清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕”的功效，在其他少數(shù)民族的醫(yī)藥典籍中亦有記載，其中景頗族的《德宏藥錄》、基諾族的《基諾藥》均記載其除了清熱解毒功效外，亦有抗腫瘤作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)[3]，白花蛇舌草多糖提取物(hedyotis diffusa polysaccharide extract，HDPE)可促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖能力，但并未進(jìn)行深入研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激本身為真核細(xì)胞為應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+紊亂及未折疊蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積的一種自我保護(hù)機(jī)制，但高強(qiáng)度而持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激易引發(fā)細(xì)胞凋亡，已成為線粒體細(xì)胞凋亡通路后又一重要的凋亡相關(guān)機(jī)制[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬多由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所激活，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激共同參與處理未折疊蛋白，緩解嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，避免細(xì)胞凋亡[5]。本研究擬培養(yǎng)喉癌Hep-2細(xì)胞，并使用不同濃度HDP進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬發(fā)生情況及增殖能力變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試藥和儀器

Hep-2細(xì)胞株由購自于美國 ATCC公司。HDPE購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號A20190213，純度≥98%；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自美國Sigma公司，批號：M9281；噻唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物有限公司，貨號C5236；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購自上海碧云天公司，貨號C1088；anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅰ、anti-LC3Ⅱ、anti-GRP78、anti-ATF6及anti-CHOP(英國Abcam公司，貨號分別為ab62557、ab627214、ab48394、ab108615、ab203119、ab179823)；山羊抗兔/鼠過氧化物酶二抗(北京康為世紀(jì)公司，貨號CW1222)。BX53型熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；muLISKAN-MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；MCO-18AC型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司；WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)購自北京六一生物科技有限公司；SD Cell 型轉(zhuǎn)移電泳槽購自美國Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將Hep-2細(xì)胞調(diào)整約為4×103cells/well接種于12孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10%FBS溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)條件下于培養(yǎng)箱中，待生長至 80%時(shí)，加入PBS 溶液清洗細(xì)胞，添加0.2%胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代時(shí)可用于后續(xù)研究。將培養(yǎng)48 h細(xì)胞棄掉上清培養(yǎng)液，分為對照組、HDPE 100、200、400 mg/L組和3-MA組，分別加入HDPE 0、100、200、400 mg/L[3]和3-MA 20 μmol/L溶液[6]，培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測

采用噻唑鹽比色法(MTT)檢測各組細(xì)胞增殖抑制率；首先用臺盼藍(lán)拒染法確認(rèn)Hep-2細(xì)胞拒染率在95%以上；常溫下收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞混懸液濃度至1×106cells/ml，以每孔200 μl細(xì)胞混懸液接種于96 孔板中，生長至>50%融合度時(shí)加入含終濃度為0、100、200、400 mg/L HDPE，及20 μmol/L 3-MA，每組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48及72 h，結(jié)束后加入MTT溶液20 μl(5 g/L)，充分反應(yīng)4 h后棄上清，每孔再加入DMSO溶液200 μl，讀取吸光度(A)波長為570 nm。

增殖抑制率%=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

1.4 熒光TUNEL染色

各組培養(yǎng)48 h細(xì)胞加入12孔板，經(jīng)過0.1% Trition X-100透化，加入3% H2O2200 μl，PBS漂洗3次后，加入蛋白酶K滅活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒溫箱中避光孵育60 min。取出后經(jīng)PBS沖洗3次加入DAPI反應(yīng)液，反應(yīng)20 min后沖洗封片。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，綠色代表已凋亡細(xì)胞，藍(lán)色代表仍生存細(xì)胞。

凋亡指數(shù)(AI)=各視野陽性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 單丹黃酰尸胺(MDC)染色觀察自噬溶酶體情況

配置含MDC的DMSO儲存液，濃度為5 mmol/L，將各組培養(yǎng)48 h的Hep-2細(xì)胞重懸于6孔板內(nèi)(細(xì)胞密度1×106cells/ml)，加入50 μmol/L MDC溶液，細(xì)胞孵育箱內(nèi)培育45 min，培育條件為37℃、5% CO2，后收集細(xì)胞；經(jīng)PBS溶液洗滌2次后，再用60 μl PBS溶液重懸，取液滴片，經(jīng)紫外光激發(fā)，綠色熒光為細(xì)胞自噬囊泡，用倒置熒光顯微鏡在相同曝光條件下隨機(jī)選取 3 個(gè)視野進(jìn)行拍照，觀察自噬空泡的變化情況并攝片，Image J軟件計(jì)算熒光度。

1.6 透射電鏡檢測自噬發(fā)生情況

選取各組培養(yǎng)48 h細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)定1×105cells/ml，無菌操作下置于6孔板中，500 μl/well，使用含 EDTA的胰酶消化細(xì)胞，加入4%戊二醛固定細(xì)胞，將固定細(xì)胞逐級乙醇脫水，用 70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染色，包埋、切片后用透射電子顯微鏡觀察Hep-2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中自噬囊泡形成情況。

1.7 Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬蛋白

取不同組別培養(yǎng)48 h 的Hep-2細(xì)胞，BCA法測定各組蛋白濃度，制備上樣液。取各組待測樣品15 μl和5 μl蛋白Marker，加入電泳裝置中，待電泳結(jié)束后進(jìn)行免疫印跡，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相關(guān)輕鏈蛋白3Ⅰ(light chain 3Ⅰ，LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose regulatory protein 78，GRP78)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activated transcription factor 6，ATF6)及CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding homologous protein，CHOP)對應(yīng)一抗(一抗比例均為1∶800)，4℃孵育過夜，PBS洗膜2次后加入二抗(1∶500)，常溫下孵育2 h，PBS洗膜3次，ECL顯像，暗室曝光，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率檢測

與對照組比較，HDPE 100、200、400 mg/L組和3-MA組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后增殖抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與3-MA組比較，HDPE 400 mg/L組培養(yǎng)24、48、72 h后增殖抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 表1)。

Tab. 1 Effects of HDPE on proliferation inhibition rate of Hep-2 n=6)

2.2 各組細(xì)胞TUNEL染色凋亡情況

TUNEL染色下正常細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核為綠色熒光。TUNEL染色結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞基本為藍(lán)色熒光，HDPE100、200、400 mg/L組及3-MA組細(xì)胞綠色熒光細(xì)胞核逐漸增多(圖1)。與對照組(AI=2.46±0.24)比較，HDPE 100、200、400 mg/L組(AI=7.62±1.33；AI=12.85±2.05；AI= 31.28±4.62)及3-MA組(AI=17.59±2.75)細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與3-MA組比較，HDPE 400 mg/L組細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig. 1 Effects of HDPE on apoptosis of Hep-2 cells (TUNEL staining × 200)

2.3 各組細(xì)胞自噬溶酶體熒光強(qiáng)度情況

與對照組[(38.47±4.35)%]比較，HDPE 100、200、400 mg/L組[(26.72±2.18)%、(16.85± 2.04)%、(8.43±1.34)%]及3-MA組[(13.67± 3.75)%]熒光強(qiáng)度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；與3-MA組比較，HDPE 400 mg/L組熒光強(qiáng)度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖2)。

Fig. 2 Effects of HDPE on autophagy lysosomes in Hep-2 cells (MDC staining × 400)

2.4 透射電子顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬發(fā)生情況

對照組細(xì)胞透射電子顯微鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍自噬囊泡出現(xiàn)較多，HDPE 100、200、400 mg/L組及3-MA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍自噬囊泡出現(xiàn)明顯減少；與3-MA組比較，HDPE 400 mg/L組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍自噬囊泡形成減少(圖3)。

2.5 各組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬蛋白表達(dá)情況

與對照組比較，HDPE 100、200、400 mg/L組及3-MA組細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與3-MA組比較，HDPE 400 mg/L組GRP78、ATF6及CHOP表達(dá)及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4，表2)。

Fig. 3 Effects of HDPE on the formation of autophagy vesicles around endoplasmic reticulum in Hep-2 cells (×2500)

Fig. 4 Effects of HDPE on GRP78, ATF6, CHOP, LC3 Ⅰ, LC3II and Beclin-1 proteins in Hep-2 cells

Tab. 2 Effect of HDPE on the expressions of GRP78, ATF6, CHOP, Beclin-1 protein and LC3Ⅰ/LC3II in Hep-2 cells (n=5)

3 討論

中藥是我國獨(dú)特且寶貴的醫(yī)療資源，是中醫(yī)長期臨床實(shí)踐，反復(fù)印證得到的寶貴經(jīng)驗(yàn)，但既往在長期的臨床應(yīng)用中，僅能探索其臨床功效，對其具體藥物作用靶點(diǎn)的研究仍需不斷探索。白花蛇舌草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用于治療疔瘡腫毒，毒蛇咬傷，其經(jīng)乙醇分離后鑒定蘆丁、槲皮素、山奈酚是白花蛇舌草黃酮類的主要成分，均具較強(qiáng)的DNA裂解能力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7，8]。在現(xiàn)代的中藥藥理研究中證實(shí)，白花蛇舌草具有抗腫瘤、炎癥、清除氧化自由基等作用[9-11]。喉癌近些年來發(fā)病率不斷上升，雖然經(jīng)常規(guī)手術(shù)及放化療治療后5年生存率可達(dá)68.2%，但仍不能滿足臨床工作者及患者的心理期望[12]。本研究采用HDPE對喉癌Hep-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且應(yīng)用自噬抑制劑3-MA為陽性對照藥物，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HDPE可有效升高Hep-2細(xì)胞增殖抑制率，說明HDPE可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞生長。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞最大的膜系統(tǒng)，不僅調(diào)控離子平衡、蛋白合成、脂質(zhì)合成、膜生成，更可激活凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[13]。腫瘤細(xì)胞由于其瘋狂生長的特性，導(dǎo)致細(xì)胞長期處于缺血缺氧狀態(tài)，易處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，激活泛素化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，以保證腫瘤細(xì)胞繼續(xù)存活、增殖[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可選擇性清除細(xì)胞內(nèi)受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段，從而起到改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，保護(hù)細(xì)胞的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)[15]，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，減少未折疊蛋白降解，可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，高強(qiáng)度而持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動凋亡程序，進(jìn)而起到降低腫瘤細(xì)胞增殖能力的作用。本研究首先通過MDC染色，發(fā)現(xiàn)不同劑量HDPE組及3-MA組細(xì)胞自噬空泡熒光度較對照組細(xì)胞熒光度降低，說明喉癌Hep-2細(xì)胞本身自噬程度較強(qiáng)，經(jīng)HDPE干預(yù)后可抑制Hep-2細(xì)胞自噬。通過透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍出現(xiàn)較多自噬囊泡及自噬小體，而經(jīng)不同劑量HDPE組及3-MA組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍自噬囊泡及自噬小體均減少。結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明HDPE可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬起到抑制Hep-2細(xì)胞增殖作用。

為了進(jìn)一步確認(rèn)HDPE對Hep-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的影響，本研究對GRP78/ATF6/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號通路及自噬標(biāo)記蛋白Beclin-1、LC3Ⅰ及LC3Ⅱ進(jìn)行檢測。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的分子伴侶蛋白，其表達(dá)程度可直接反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，也是對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)[16，17]。ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅱ型跨膜蛋白，其N端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并活化CHOP，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Beclin-1及LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ比值已被公認(rèn)為自噬標(biāo)記蛋白，均可在分子層面反應(yīng)細(xì)胞自噬發(fā)生與否[19，20]。本研究證實(shí)，經(jīng)HDPE及3-MA干預(yù)后，Hep-2細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表達(dá)降低。說明Hep-2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬同時(shí)發(fā)生，共同降解錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白，維持細(xì)胞生殖能力。而HDPE可能通過抑制Hep-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，降低腫瘤細(xì)胞處理未折疊蛋白能力，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而起到抑制細(xì)胞增殖作用，這也與MTT、MDC染色及透射電鏡觀察結(jié)果相一致。

綜上所述，HDPE可能通過抑制Hep-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號通路的敏感性，從而降低Hep-2細(xì)胞增殖能力，起到抑制腫瘤增殖作用。而自噬普遍存在于多種腫瘤中，抑制自噬可在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞增殖，本研究結(jié)果也可為其他腫瘤治療提供思路。