湯 娟， 柯 潔， 付 裕， 何曉偉， 李先偉△

(1．皖南醫(yī)學院藥學院病理學教研室， 2．皖南醫(yī)學院醫(yī)學影像學院， 3．皖南醫(yī)學院臨床醫(yī)學院， 安徽 蕪湖 241002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種呼吸系統(tǒng)罕見疾病，其特征是肺結(jié)締組織過度增生，導(dǎo)致肺間隔增厚、肺部瘢痕形成、進行性嚴重呼吸困難等[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細胞逐漸向間充質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化、喪失上皮細胞功能特性而獲得間質(zhì)細胞(如肌成纖維細胞)特性的過程，在PF的發(fā)病過程中起著重要作用[2,3]，但其具體發(fā)生機制目前還不是很清楚。

近來的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介導(dǎo)的Notch-1信號通路與了肺泡上皮細胞EMT進程，在PF的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[4]。我們前期的研究也證實了Notch-1參與了肺泡上皮細胞EMT的發(fā)生[5]。但Notch-1是如何影響肺泡上皮細胞EMT進程的，目前不是很清楚。Twist-1是一種進化上高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，具有調(diào)控胚胎發(fā)育、誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT等功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化病人肺組織中Twist-1的表達明顯升高[7]，而進一步研究表明Twist-1介導(dǎo)的肺泡上皮細胞EMT參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[8]。而最新研究發(fā)現(xiàn)Notch-1/Twist-1信號通路參與了直腸癌細胞的EMT進程[9]?；谝陨涎芯勘尘?，本研究以肺纖維化大鼠和Ⅱ型肺泡上皮細胞為研究對象，以Notch-1/Twist-1信號通路為突破口，探討肺泡上皮細胞EMT的發(fā)生機制，進而為PF的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購于南京青龍山動物養(yǎng)殖場(許可證號：SCXK(蘇)2018-0012)。大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞購于北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司(貨號：CP-R003)。

1.2 實驗試劑

注射用鹽酸博萊霉素(國藥準字H20055883，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)購于美國R&D Systems公司(編號7754-BH)。改良 Masson 三色染色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號S0075)。PrimeScriptTMRT reagent Kit(編號RR047A)和TB Green? Premix Ex TaqTMII(編號RR820A，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)。兔抗鼠TGF-β1抗體(編號bs-0086R)、兔抗鼠Notch-1抗體(編號bs-1335R)、兔抗鼠(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(編號bs-10900R)、小鼠抗大鼠I型膠原(collagen I)抗體(編號bsm-33400M)及小鼠抗大鼠III型膠原(collagen III)抗體(編號bsm-33129M)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。小鼠抗大鼠E-鈣粘蛋白(E-Cadherin)抗體(編號 sc-8426)、大鼠抗大鼠緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)抗體(編號sc-33725)、小鼠抗大鼠N-鈣粘蛋白(N-Cadherin)抗體(編號sc-59987)、小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)抗體(編號sc-6260)及小鼠抗大鼠Twist -1抗體(編號sc-81417)購于美國Santa Cruz公司 。兔抗鼠Notch-1胞內(nèi)域(Notch1 intracellular domain, NICD)抗體(編號ab83232)和兔抗鼠Hes-1抗體(編號ab108937)購于美國Abcam公司。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 動物實驗 SD大鼠30只隨機分為對照(Control, CON)組、博萊霉素(Bleomycin, BLM)組，每組例數(shù)n=15。按BLM(7 500 U/kg)劑量分兩次、中間間隔30 min氣管注射制備肺纖維化大鼠模型。CON組氣管滴注等量的滅菌生理鹽水，其余方法與BLM組相同。造模后28 d處死動物，觀察相關(guān)指標。

1.3.2 細胞實驗 實驗設(shè)Control組、TGF-β1(5 ng/ml)組、TGF-β1+ Notch1 siRNA陰性對照組(NC siRNA, 100 pmol/L)和TGF-β1+Notch1 siRNA干擾組(Notch1 siRNA, 100 pmol/L)。Ⅱ型肺泡上皮細胞(RLE-6TN)計數(shù)后接種于6孔板。細胞先用TGF-β1處理24 h，然后加入NC siRNA(100 pmol/L) 或Notch1 siRNA(100 pmol/L)和lipofectamine 3000(5 μl)，再加入TGF-β1共處理48 h。每組設(shè)9個復(fù)孔。

1.4 肺組織形態(tài)學觀察和膠原沉積分析

肺組織用10%福爾馬林灌流后，取左肺下葉，根據(jù)參考文獻[10]方法進行HE及Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化及膠原沉積情況。

1.5 肺組織TGF-β1免疫組化染色

肺組織用10%福爾馬林灌流后，取左肺下葉，根據(jù)SABC-AP(鏈酶親和素-堿性磷酸酶)免疫組化法檢測肺組織TGF-β1蛋白表達，TGF-β1一抗?jié)舛葹?∶800，相應(yīng)二抗?jié)舛葹?∶2 000。肺組織TGF-β1陽性表達呈黃至棕黃色顆粒。

1.6 大鼠肺組織和Ⅱ型肺泡上皮細胞collagen I、collagen III、ZO-1、E-cadherin、Vimentin及N-cadherin基因表達分析

無酶環(huán)境下提取左肺上葉和細胞總RNA，測定濃度后將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以2 μl cDNA為模板，20 μl反應(yīng)體系，用StepOnePlusTMReal-Time PCR System進行qPCR擴增。PCR反應(yīng)條件參照我們前期的研究結(jié)果[11]。以GAPDH為內(nèi)參，統(tǒng)計各組ΔΔCt值，計算相應(yīng)RQ值并進行分析。引物列表如下(表1)。

Tab. 1 Nucleotide sequences of primers for real-time PCR amplification

1.7 大鼠肺組織和Ⅱ型肺泡上皮細胞相關(guān)蛋白表達分析

低溫條件下提取右肺組織及細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達，具體方法詳見我們前期的研究結(jié)果[11]。相關(guān)蛋白一抗?jié)舛确謩e為N-cadherin(1∶500)、Vimentin(1∶500)、ZO-1(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、collagen I(1∶1 000)、collagen III(1∶500)、Notch-1(1∶1 000)、NICD(1∶1 000)、Hes-1(1∶500)和Twist-1(1∶500)及GAPDH(1∶2 000)，相應(yīng)二抗?jié)舛?1∶2 000～1∶5 000)。用Image J 1.43軟件進行灰度值測量并分析蛋白表達情況。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織形態(tài)學變化

HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Control組肺組織支氣管、細支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥反應(yīng)，而Bleomycin組肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮和塌陷并發(fā)生融合，肺泡壁增寬增厚明顯，且可見大量炎性細胞的浸潤及分泌物，纖維化顯著。上述結(jié)果表明Bleomycin誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型成功(圖1)。

Fig. 1 Rat lung tissues paraffin sections were stained with HE staining (×200)

2.2 大鼠肺組織TGF-β1表達狀況觀察

Westernblot和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Bleomycin組TGF-β1蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01，圖2，圖3)。提示肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1的表達明顯升高。

Fig. 2 Representative bands of TGF-β1 expression in rat lung tissue

Fig. 3 Representative micrographs of the immunostaining for TGF-β1 in rat lung tissue (Arrows indicate collagen I immunostaining positive ×200)

2.3 大鼠肺組織及Ⅱ型肺泡上皮細胞Notch-1、NICD、Hes-1及Twist-1蛋白表達情況觀察

動物實驗發(fā)現(xiàn)BLM能夠使肺組織中Notch-1、NICD、Hes-1及Twist-1蛋白表達明顯升高(P< 0.01，圖4，表2)。細胞實驗結(jié)果顯示，TGF-β1能夠明顯上調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細胞Notch-1、NICD、Hes-1及Twist-1的蛋白表達(P<0.01)。但與TGF-β1組相比，Notch-1 siRNA組Notch-1、NICD、Hes-1及Twist-1的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，而Notch-1 siRNA陰性對照組無此作用(圖5，表3)。

Fig. 4 Representative bands of Notch1, NICD, Hes1 and Twist1 expression in rat lung tissue

Tab. 2 Western blot analyses for Notch1, NICD, Hes1 and Twist1 expressions in lung tissues n=8)

Fig. 5 Representative bands of Notch1, NICD, Hes1 and Twist1 expression in cultured type II alveolar epithelial cells

2.4 大鼠肺組織及Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT相關(guān)標志物表達情況觀察

動物實驗發(fā)現(xiàn)BLM能夠使肺組織上皮細胞標志物ZO-1和E-cadherin mRNA及蛋白表達水平明顯降低而使間質(zhì)細胞標志物N-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.01vsCON，圖6，表4)。細胞實驗結(jié)果顯示，TGF-β1能夠明顯下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細胞ZO-1和E-cadherin mRNA及蛋白表達、顯著上調(diào)Vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白表達(P<0.01vscontrol)。但與TGF-β1組相比，Notch-1 siRNA組ZO-1和E-cadherin mRNA及蛋白表達水平明顯升高而N-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.01vsTGF-β1)，而Notch-1 siRNA陰性對照組無此作用(圖7，表5，表6)。

Tab. 3 Effects of Notch-1 siRNA on TGF-β1-induced expressions of Notch1, NICD, Hes1 and Twist1 in cultured type II alveolar epithelial cells n=9)

2.5 大鼠肺組織及Ⅱ型肺泡上皮細胞I 型膠原和III型膠原表達情況觀察

改良Masson染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CON組藍染的膠原纖維較少，而BLM組藍染的膠原纖維明顯增多。經(jīng)qPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，BLC組I 型膠原和III型膠原mRNA及蛋白表達明顯增加(P<0.01vsCON，圖8，圖9，表7)。細胞實驗結(jié)果顯示，TGF-β1能夠明顯上調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細胞I 型膠原和III型膠原mRNA及蛋白表達(P<0.01vscontrol)。但與TGF-β1組相比，Notch-1 siRNA組I 型膠原和III型膠原mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.01vsTGF-β1)，而Notch-1 siRNA陰性對照組無此作用(圖10，表8)。

Fig. 6 Representative bands of ZO-1, E-cadherin, Vimentin and N-cadherin expressions in rat lung tissue

Fig. 7 Representative bands of ZO-1, E-cadherin, Vimentin and N-cadherin expressions in cultured type II alveolar epithelial cells

Tab. 4 Real-time PCR and western blots analyses for ZO-1, E-cadherin, Vimentin and N-cadherin expressions in lung tissues n=8)

Tab. 5 Effects of Notch-1 siRNA on TGF-β1-induced expressions of ZO-1, E-cadherin, Vimentin and N-cadherin mRNA in cultured type II alveolar epithelial cells n=9)

Tab. 6 Effects of Notch-1 siRNA on TGF-β1-induced expression of ZO-1, E-cadherin, Vimentin and N-cadherin proteins in cultured type II alveolar epithelial cells n=9)

Fig. 8 Rat lung tissue paraffin sections were stained with Masson staining (×200)

Fig. 9 Representative bands of collagen I and collagen III expression in rat lung tissue

Tab. 7 Real-time PCR and western blots analyses for collagen I, collagen III and TGF-β1 expressions in lung tissues n=8)

Fig. 10 Representative bands of collagen I and collagen III expression in cultured type II alveolar epithelial cells

Tab. 8 Effects of Notch-1 siRNA on TGF-β1-induced expressions of collagen I and collagen III mRNA and proteins in cultured type II alveolar epithelial cells n=9)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞在某些刺激因素的刺激下可失去其原有的極性，導(dǎo)致細胞連接和極性的喪失和上皮標志物逐漸丟失，進而分化為間充質(zhì)樣(成纖維細胞樣)細胞并獲得一定的遷移和游走能力，這種上皮細胞在形態(tài)學和生理特性的改變稱之為EMT[12]。已知肺泡上皮細胞包括I型和II型，正常生理情況下，II型肺泡上皮細胞可以增殖分化為I型肺泡上皮細胞并分泌大量的富含磷脂的肺表面活性劑，降低肺泡表面張力，防止肺泡塌陷，以維持肺泡壁結(jié)構(gòu)的完整性[5]。但當病因相關(guān)慢性肺損傷因素持續(xù)存在時，II型肺泡上皮細胞增殖和分化為I型肺泡上皮細胞的能力明顯降低，在促纖維化因子如TGF-β1、TNF-α等的作用下肺泡上皮細胞標志物(如E-cadherin和ZO-1等)逐漸丟失而間質(zhì)細胞標志物(如N-cadherin和Vimentin等)逐漸增加，導(dǎo)致EMT的產(chǎn)生[13,14]。博萊霉素(bleomycin)是一種細胞毒性抗惡性腫瘤藥物，它能與銅或鐵離子絡(luò)合，使氧分子轉(zhuǎn)化為氧自由基而使腫瘤細胞DNA單鏈斷裂、阻滯DNA的復(fù)制，干擾細胞分裂增殖[15]。該藥的毒副作用之一是引起肺纖維化，在動物實驗上證實，博萊霉素所致肺纖維化病理組織學改變與人類肺纖維化非常相似，被普遍作為研究肺纖維化的模型[16]。而本實驗也證明了這一點，我們發(fā)現(xiàn)在博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中，肺組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮和塌陷并發(fā)生融合，肺泡壁增寬增厚明顯，且可見大量炎性細胞的浸潤及分泌物，纖維化顯著。同時，肺組織藍染的膠原纖維明顯增多，collagen I和collagen III的表達明顯增加。另外，肺組織中E-cadherin和ZO-1表達明顯下降而N-cadherin和Vimentin的表達明顯增加。這些結(jié)果進一步表明，在肺纖維化發(fā)病過程中，肺泡上皮細胞發(fā)生了EMT，但具體機制目前還不是很清楚。

Twist-1是一種進化上高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控胚胎發(fā)育、誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT等功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化病人肺組織中Twist-1的表達明顯升高[7]，進一步研究表明當Twist-1激活后，導(dǎo)致上皮細胞標記物如E-鈣粘蛋白表達下調(diào)而間質(zhì)細胞標記物如N-鈣粘蛋白、波形蛋白表達上調(diào)，改變細胞形態(tài)，誘導(dǎo)肺泡上皮細胞EMT的發(fā)生[8]。而本實驗結(jié)果顯示，在BLC誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中Twist-1的表達明顯升高，體外實驗我們進一步發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β1能夠明顯誘導(dǎo)II型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT(N-cadherin和Vimentin表達明顯升高而E-cadherin 及ZO-1表達明顯降低)，I和III型膠原的表達明顯也升高，同時伴隨著Twist-1的表達上調(diào)。但促纖維化因子如TGF-β1是通過何種途徑誘導(dǎo)Twist-1的表達進而介導(dǎo)II型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT，目前尚不清楚。

最近研究發(fā)現(xiàn)Notch-1信號通路與細胞的增殖、分化，收縮、遷移等細胞生物學功能密切相關(guān)[17]。除此之外，Notch-1信號通路也被證實參與了多種組織的纖維化過程，如腎纖維化、肝纖維化和肺纖維化等[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)在肺纖維化發(fā)展過程中，當Notch-1信號通路激活后，釋放出NICD并進入細胞核，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子C啟動子結(jié)合因子-1結(jié)合，進而誘導(dǎo)其下游轉(zhuǎn)錄因子Hes-1的表達上調(diào)，促進II型肺泡上皮細胞EMT，導(dǎo)致ECM分泌增加，從而促進肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[21,22]。我們的研究也證實了上述的觀點，即在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中Notch-1、NICD和Hes-1的表達明顯上調(diào)，同時外源性TGF-β1能夠明顯誘導(dǎo)II型肺泡上皮細胞Notch-1、NICD和Hes-1的表達，而用Notch-1的siRNA干擾片段抑制Notch-1的表達后，NICD、Hes-1和Twist-1的表達明顯降低，同時肺泡上皮EMT明顯被抑制(N-cadherin和Vimentin表達下調(diào)而E-cadherin 及ZO-1表達上調(diào))，collagen I和collagen III的表達明顯減少。

綜上所述，Twist-1參與了II型肺泡上皮細胞EMT進程，其機制可能與TGF-β1介導(dǎo)的Notch-1信號通路激活有關(guān)。但也有文獻報道[23]，Notch-3信號通路也參與了II型肺泡上皮細胞EMT，而Twist-1介導(dǎo)的II型肺泡上皮細胞EMT是否也與Notch-3信號通路有關(guān)，值得進一步探討。