袁前發(fā)， 何 玨， 徐志忠， 林多朵， 朱敬敬， 溫春燕， 段海珍， 王文強(qiáng)△

(1. 廈門市仙岳醫(yī)院精神衛(wèi)生研究室， 福建 廈門 361000； 2. 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)疾病研究所， 開封 475000；3. 廈門市海滄醫(yī)院急診科， 福建 廈門 361000)

抑郁癥在全球范圍內(nèi)是一個(gè)負(fù)擔(dān)性疾病，其終生患病率為2%～25%[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，抑郁癥的發(fā)病率和死亡率將很快僅次于心肌缺血性疾病[2]。然而，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，但可以確定抑郁癥的發(fā)生與生物、生理和社會(huì)環(huán)境等諸多方面因素有關(guān)[3,4]。目前市面上的化藥抗抑郁藥物的常規(guī)劑量可在一定程度上緩解抑郁癥患者臨床癥狀，但不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，且長時(shí)間應(yīng)用常規(guī)化藥劑量可能會(huì)產(chǎn)生一些肝腎等毒副作用。因此，積極尋找一種副作用少或無的治療抑郁癥方法顯得尤為重要。

氟西汀是一種常用的且效果較明顯的抗抑郁藥，可選擇性地抑制5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體，阻斷突觸前膜對5-HT的再攝取，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。馮巖巖等[5]研究表明，氟西汀劑量為10 mg/kg時(shí)能夠改善大鼠抑郁狀態(tài)，但目前的臨床有效劑量會(huì)產(chǎn)生一定的副作用，且患者依從性較差。最近研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者給與重復(fù)經(jīng)顱磁刺激治療后，其癥狀有明顯改善[6]。經(jīng)顱刺激(transcranial magnetic stimulation，TMS)技術(shù)是Barker等在1985年創(chuàng)立的一種無電極刺激形式，而重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，并且具有無創(chuàng)傷、無痛苦、無副作用等治療效果[7]，但有關(guān)其長期效應(yīng)信息十分有限，且針對rTMS治療抑郁患者的特點(diǎn)綜合分析文獻(xiàn)報(bào)道也少見[8,9]?；谏鲜鲅芯勘尘埃狙芯坎捎媚壳皬V泛應(yīng)用的“慢性不可預(yù)知輕度壓力(chronic unpredictable mild stress, CUMS)”刺激方法復(fù)制小鼠抑郁模型，評價(jià)rTMS聯(lián)合低劑量氟西汀對抑郁的干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氟西汀(生產(chǎn)批號：100513-201602，中國食品藥品檢定研究院)溶于0.9%生理鹽水中配成1 mg/ml注射液；經(jīng)顱磁刺激儀購于武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Balb/c小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)于濕度 40%～50%、溫度(24.0±1.0)℃的通氣籠系統(tǒng)。小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物使用許可證號: SYXK(京) 2016-0006，質(zhì)量合格證號: 1100111911014985。

1.3 析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)

選取rTMS和Fluoxetine 2個(gè)治療方式作為研究因素，即 A ：rTMS治療 、B ：Fluoxetine治療，每個(gè)因素各取2個(gè)水平( 1不用、2用) ，將2個(gè)因素不同水平交叉組合，共得到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組( 即4個(gè)實(shí)驗(yàn)方案) ，如表1。

Tab. 1 2×2 factorial design and experimental scheme

1.4 抑郁癥小鼠模型構(gòu)建

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行單籠孤養(yǎng)，并施加每天包括固定在塑料管內(nèi)、鼠籠傾斜、不筑巢、擁擠環(huán)境、明暗顛倒、白噪聲等6種刺激方法，每日2種，每種刺激出現(xiàn)1次，同樣刺激方式不同時(shí)出現(xiàn)，按照隨機(jī)原則分布各個(gè)應(yīng)激周期中。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

42只無特定病原體級小鼠，隨機(jī)分為正常對照組(Control，n=7)和抑制癥模型組(Model，n=35)，Model小鼠給予4周CUMS刺激。行為學(xué)評價(jià)后，Model組小鼠再次隨機(jī)分為CUMS組(即A1B1，8只)、Fluoxetine組(即A1B2，9只)、rTMS組(即A2B1，9只)和rTMS+Fluoxetine組(即A2B2，9只)，并分別施加不同程序治療，隨后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.6 藥物干預(yù)

rTMS治療采用帶有八字形線圈((B9076；內(nèi)徑22 mm，外徑90 mm，組合長軸長度76 mm)的CCY-II電磁刺激器，磁刺激器的最大刺激器強(qiáng)度為6.0 T，刺激小鼠背外側(cè)前額葉皮層上。rTMS參數(shù)如下[11]：刺激頻率= 10 Hz，刺激脈沖強(qiáng)度= rTMS設(shè)備最大功率的70%，刺激時(shí)間= 5 s，包括50個(gè)脈沖，刺激間隔為30 s，連續(xù)刺激4周；氟西汀每天按5 mg/kg腹腔注射，正常對照組和CUMS模型組給予相同體積生理鹽水腹腔注射，同時(shí)未施加rTMS治療的組給與rTMS偽刺激，即置于相同的環(huán)境，線圈不通電，即無電流脈沖，只施予同樣次數(shù)的聲音刺激，各組均連續(xù)給與治療4周。

1.7 體重測量

分別在實(shí)驗(yàn)的第 1、14、28、42、56 日稱量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重并計(jì)算體重變化率，計(jì)算公式如：

體重變化率(%) =(第 14、28、42、56 日的體重-第1日的體重)÷第 1 日的體重×100%

1.8 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

為避免測試結(jié)果的晝夜節(jié)律改變，測試時(shí)間為上午9:00至上午11:00之間。

1.8.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 迫使小鼠在裝有15 cm水(水溫保持22-23℃)的透明塑料圓筒中游泳6 min，記錄后4 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)是垂直漂浮在水中，同時(shí)僅進(jìn)行那些必要的動(dòng)作以將頭保持在水面上方，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠移出并在加熱燈下加熱直到其身體干燥。

1.8.2 曠場實(shí)驗(yàn) 小鼠放置在尺寸為90 cm×90 cm×30 cm的木箱(內(nèi)部劃分為36個(gè)大小相同的正方形)中5 min，用ANY-maze軟件記錄和分析小鼠在測試時(shí)間內(nèi)跨越方塊的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)完成后將小鼠取出，在木箱內(nèi)噴灑10%的乙醇溶液清潔儀器，以消除其運(yùn)動(dòng)痕跡對后面測試的影響。

1.8.3 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 小鼠適應(yīng)性習(xí)慣兩個(gè)飲水瓶3 d后，將每只小鼠單獨(dú)分籠，每籠中放置兩個(gè)飲水瓶，一個(gè)為1%蔗糖瓶，另一個(gè)含水瓶，測量對水和蔗糖溶液的攝入量體積，同時(shí)每天更換兩個(gè)瓶子的位置以減少實(shí)驗(yàn)誤差。計(jì)算公式如下。

蔗糖偏好= V(蔗糖溶液)/[V(蔗糖溶液)+ V(水)]×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Fluoxetine聯(lián)合rTMS對小鼠體重變化率的影響

各組小鼠體重變化率見圖1。造模4周后，與Control組比，其余4組小鼠體重變化率呈明顯減緩趨勢，差異具有顯著性(P<0.05)。治療4周后，與Control組比，CUMS組小鼠體重變化率明顯下降(P<0.01)；與CUMS組比，rTMS+Fluoxetine組小鼠體重變化率明顯升高(P<0.05)，而rTMS組和Fluoxetine組小鼠體重變化率差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 Fluoxetine聯(lián)合rTMS對行為學(xué)變化的影響

結(jié)果表明，與Control組比較，CUMS組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著升高，曠場實(shí)驗(yàn)中心穿越次數(shù)顯著下降，蔗糖偏好率顯著下降(P均<0.05，表2)。與CUMS組小鼠比較，F(xiàn)luoxetine和rTMS組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間均顯著下降(P<0.01)，礦場實(shí)驗(yàn)中心穿越次數(shù)均顯著升高(P<0.05)。小鼠蔗糖偏好率顯著增加(P<0.05)。與單用Fluoxetine和單用rTMS組小鼠比較，聯(lián)合組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著下降(P<0.05)，曠場穿越次數(shù)及對蔗糖偏好率均顯著增加(P<0.01)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，F(xiàn)luoxetine聯(lián)合rTMS應(yīng)用對CUMS小鼠抑郁的干預(yù)具有協(xié)同作用(P<0.05，P<0.01)。

Fig. 1 Change rate of body weight of mice in each group

Tab. 2 Effect of fluoxetine combined with rTMS on behavioral changes

3 討論

抑郁癥患者的主要臨床癥狀為興趣缺乏或喪失，活動(dòng)能力顯著下降，情感缺乏等[12]。動(dòng)物模型是進(jìn)行發(fā)病機(jī)制和藥物開發(fā)的重要輔助工具，對于抑郁癥，抑郁癥小鼠模型的建立是本研究的基礎(chǔ)，而CUMS是一種被廣泛認(rèn)可的抑郁癥動(dòng)物模型，具有良好的外觀效應(yīng)、預(yù)測性和建構(gòu)效度，趙燕[13]等研究表明，大鼠在CUMS慢性刺激21 d后，活動(dòng)力明顯下降，出現(xiàn)抑郁樣行為。而在本研究中對造模方式進(jìn)行改進(jìn)，去除冷刺激和夾尾等，增加白噪音，避免過度刺激引起其它影響，這一改進(jìn)方法在本課題組以往的研究中已多次被應(yīng)用[10]。而對動(dòng)物的抑郁狀態(tài)通常采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來檢測，如蔗糖實(shí)驗(yàn)通過對獎(jiǎng)賞的反應(yīng)，檢測快感缺失的程度，評定抑郁狀態(tài)；曠場實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力、探究能力；強(qiáng)迫游泳是一種行為絕望實(shí)驗(yàn)法，用來測驗(yàn)抑郁類行為。本研究通過對小鼠實(shí)行CUMS刺激4周，抑郁模型組動(dòng)物體重表現(xiàn)出明顯緩慢增長、糖水偏愛程度明顯下降、對新鮮環(huán)境的好奇程度顯著降低、精神運(yùn)動(dòng)遲滯及行為絕望等抑郁樣行為，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均反映出了抑郁癥的主要癥狀。

郭進(jìn)[14]等利用跨顱電刺激驗(yàn)證其對大鼠抑郁癥有治療作用，但需將刺激電極置于顱骨皮膚表面，通以微弱電流達(dá)到刺激大腦皮層的方法，操作比較繁瑣。rTMS利用磁場作用于大腦皮層產(chǎn)生感應(yīng)電流改變皮層神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位，從而影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)，是一種具有無創(chuàng)傷且方便操作的生物刺激技術(shù)，研究表明rTMS可能影響人的情感[15,16]。已有許多證據(jù)表明抑郁癥與患者的左前額葉皮層功能障礙有關(guān)，這些研究結(jié)果對rTMS干預(yù)抑郁癥選擇左前額葉為最佳刺激部位提供了客觀依據(jù)[17]。本實(shí)驗(yàn)采用高頻rTMS刺激小鼠背外側(cè)前額葉皮層上，同時(shí)給與低劑量氟西汀干預(yù)，結(jié)果表明rTMS對低劑量Fluoxetine改善抑郁癥小鼠的抑郁行為具有促進(jìn)作用，同時(shí)，兩者聯(lián)合應(yīng)用后更能改善抑郁癥模型組小鼠的抑郁行為。

綜上所述，rTMS聯(lián)合低劑量Fluoxetine均能改善CUMS小鼠的體重增長，升高糖水偏好程度，增加對新鮮環(huán)境的好奇程度，降低精神運(yùn)動(dòng)遲滯和行為絕望，從而對抑郁癥有一定的改善作用，有關(guān)其干預(yù)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。